BIOKATALIZÁTOROK

1. BIOKATALIZÁTOROK Fontos ipari enzimek

2. biokatalizátorok • Fehérjék (enzimek), élő szervezetben a kémiai reakciókat katalizálják, de képesek az élő szervezeten kívül is aktívan működni • Nukleinsavak (ribozimek), melyek elsősorban az RNS hidrolizisét katalizálják

3. „A titkos fegyver” • Mit tudnak a mikroorganizmusok? a legkülönbözőbb szerves vegyületek átalakítására képesek enzimek konstitutív indukálható • Biokonverzió, biotranszformáció = mikrobiális átalakítás

4. ismétlés • Az enzimek fehérjék, különböző reakciókat katalizálnak megfelelő körülmények között • működésük hőmérséklet és pH függő • Az enzimek specifikusak:reakcióspecifikusak, ill. szubsztrátspecifikusak (vegyület, vagy vegyületcsoport adott reakcióját katalizálják),néhány enzim un. széles szubsztrát specifitással, bír, azaz többféle vegyület átalakítására képes • Ipari, biotechnológiai jelentőségük óriási • Számos enzim vesz részt biodegradációs folyamatokban

5. Enzimek, mint katalizátorok • Reakciókhoz katalizátorokra van szükség enzimek Átmeneti állapot Eαkatalizátor nélkül Eαkatalizátorral Szabad energia Reaktáns (kiindulási állapot) A reakció szabadenergia változása Termék (végállapot) A reakció iránya kinetika (biokémia – Michelis-Menten kinetika)

6. Csoportosításuk International Union of Biochemistry (IUB) az enzimeket osztályozták (4 számmal jelölik) 1. Oxidoreduktázok: oxidációs-redukciós reakciókpl. alkohol dehidrogenáz, metán-monooxigenáz 2. Transzferázok: atomcsoport áthelyezés pl. aminotranszferázok, foszfotranszferázok 3. Hidrolázok: kovalens kötés hasítása víz belépésévelpl. észterázok, lipázok, glükozidázok, proteázok, 4. Liázok: kötések hasítása nem hidrolitikus reakcióvalpl. piruvát dekarboxiláz 5. Izomerázok: molekulán belüli átrendezéspl. fruktóz izomeráz, ribulóz foszfát epimeráz 6. Ligázok: szintetázok: két molekula kapcsolása, ATP-t igénylő karboxilázok: CO2 megkötését katal. pl. piruvát karboxiláz

7. biotechnológiai eljárások szempontjából legfontosabb tipusú enzimek és enzim-katalizált reakciók Számos enzim vesz részt biodegradációs folyamatokban • Oxidáció: aromás gyűrű oxidatív hasítása, pl. oxigenázok hidroxiláció, pl. hidroxilázok heteroatomok oxidálása (pl. amino csoport nitro csoporttá)oldallánc oxidatív hasítása • Redukció: karboxil csoport redukció, pl. dekarbozilázok heterocsoport redukció kettős kötés redukció • Hidrolizis – hidrolázok-Depolimerizáció: fehérje polimerek hasítása pl.proteázok,cukor polimerek hasítása pl. amilázok, cellulázoklipidek bontása: lipázok, észterázok

8. kofaktorok • Enzimek egy része képes önmagában hatékonyan katalizálni a reakciókat, míg másoknak segítő komponensek kellenek • speciális kofaktorokat (pl. fémion, szerves vegyület) un. prosztetikus csoportokat (ha szorosan kapcsolódik az enzimhez) vagy koenzimeket (lazán kapcsolódó) használnak (ha a koenzimet eltávolítjuk, a maradék fehérjét apoenzimnek hívjuk, a teljes aktív enzimet holoenzimnek) • A legtöbb mikroorganizmus képes a koenzimeket szintetizálni. Pl. NAD, NADP, FAD, citokrómok, ubiquinon,CoenzimA,... meghatározott csoport átviteléért felelősek, főleg elektron transzfer, esetleg funkciós csoport transzfer (acil, metil,). Előnyük, hogy laza kapcsolódásuk az enzimhez lehetővé teszi, hogy több enzimnek is segítségére legyenek.

9. sokféleség • Az evolúció során az egyes enzimek szerkezete, specificitása, aktivitása változott • Kialakultak eltérő szekvenciájú, de hasonló feladatot ellátó enzimek • Egyes enzimeket kódoló gének sokszorozódhattak az evolúció során, így ezek többszörösen is előfordulnak a genomban. Előfordulhat, hogy ezután egymástól függetlenül némileg módosultak, így specifitásuk, aktivitásuk is

10. A különböző (ipari) enzimek eladási aránya

11. PROTEÁZOK • Minden élő szervezetben • Növényi proteázok: pl. • Papain (Carica papaya) • Bromelain • Keratinázok • Állati proteázok: pl. • Tripszin • Kimotripszin • Pepszin • Renin • Mikrobiális proteázok – nagyon sokféle • Bakteriális • Gomba eredetű • Vírusok által termelt

12. PROTEÁZOK • Általánosan elterjedtek • Extracelluláris, intracelluláris proteázok • Az extracelluláris proteázok ritkán konstitutívan termelődnek,általában akkor indukálódnak, ha éhezik a sejt • Fontos ipari enzimek (mosószer-, tejipar)

13. PROTEÁZOK Csoportosításuk:I. Exo-, endopeptidázok II. pH optimum alapján1. Alkalikus 2. Semleges 3. Savanyú proteázok III. aktív centrumban lévő aminosavak/fémek szerint:1. Szerin- I, II pl. Chymotrypsin, trypsin; subtilisin 2. Cisztein- pl. papain 3. Aszparagin- pl.penicillopepsin, renin 4. Metallo- I., II. (stb.) prtoeázok pl. bovine carboxypeptidase A; thermolysin

14. Proteázok specifitása

15. Fontosabb ipari alkalmazásuk • Savanyú proteázok: sajtgyártás során (renninszerű p.), orvosi gyakorlatban (pepszinszerű p.), sütőiparban • Semleges proteázok – viszonylag instabilak: bőriparban (kőmosott farmer, bőr puhítás) élelmiszeriparban • Alkalikus proteázok – stabilak erősen lúgos környe- zetben és magas hőm-en: mosószeriparban • A legismertebb proteáz termelők pl. Bacillus fajok

16. Amilázok I • Amilázok hőstabilak, alacsony pH-n (<6,0) is aktívak, könnyen előállíthatók • a-amiláz (α-1,4-D-glükán-glükonohidroláz): • keményítő, glikogén, és rokon poliszaharidok α-1,4-glikozidos kötéseinek hasítása • három doménből álló endoenzim, véletlenszerűen hasítja a polimert, oligoszaharidok keletk., a hosszabb láncokat könnyebben bontja • extracellulárisan fejti ki hatását, termék gátlás (glükóz) • Ca igény az enzim aktív térszerkezetének kialakításához • Hasznosítása: alkohol termelés, keményítő bontás • Termelő fajok: Aspergillus niger, Bacillus subtilis, B. licheniformis, de megtalálható a nyálban, hasnyálmirigy is termeli, növényekben is • A kül. eredetű enzimek sok tul-ban hasonlóak, de el is térnek egymástól (pH, hőm. opt) • b-amiláz: • nem redukáló láncvégekről hasít le maltózt • Stabilabb, nincs Ca igénye • Egyes Streptomyces, Pseudomonas fajokban, növényekben

17. Amilázok II Glükoamiláz: • elágazásoknál hasít, de mindhárom féle hasítrásra képes • Termelő fajok: Aspergillus niger Pullulanáz (izoamiláz): • amilopektin elágazódásainál, az a-1,6-kötéseit hasítja • Termelő fajok: Pullularia pullulans, Bacillus acidopullolyticus

18. Keményítő szerkezete, enzimatikus hasítása • a-amiláz oligoszacharidokra (dextrinek) bontja • b-amiláz láncvégi nem redukáló csoportoknál hasít le maltózokat • Glükoamiláz a keményítőben meglévő mindhárom féle kötést képes bontani

19. cellulázok • Enzimrendszer: endo-, exocellulázok, b-glükozidázok • Extracelluláris, ill. sejtek felszínén • Termelő fajok (baktériumok, eukarióta gombák): Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor, Cellulomonas fajok • Endocelluláz: endoglukanáz random hasít oligomerekre • Exocelluláz: exoglukanáz láncvégről dimereket – cellobióz- hasít - b-glükozidáz: cellobiáz cellobiózt kettéhasítja glükózokra • Hasznosítás: bioüzemanyaggyártásban: bioetanol, biogáz

20. Cellulóz és hasító enzimei

21. Cellulóz bontó mikroorganizmusok • 1970-es évek: olajválság megújuló energiaforrások kutatása (cellulózból etanol és más hasznos vegyület termelése) • Trichoderma gombák - egyedi enzimek dolgoznak egymással szinergizmusban (aeroboknál általában igaz) pl.: Trichoderma reesei • termofil Clostridiumok (Gram pozitív, obligát anaerob) pl.: C. thermocellum, C. cellulolyticus - cellulóz kötő faktorok (cellulose binding factor = CBF)

22. celluloszóma • sok van a sejt felszínén és extracellulárisan, a táptalajban is • nagy molekula, kb. 2000 kDa • extracellulárisan rakódik össze • nagy celluláz-aktivitás • az enzimösszetételt valószínűleg a szubsztrát is befolyásolja • extracelluláris szupramolekuláris komplex, ami hatékonyan bontja a cellulózt

24. Miért előnyös a celluloszóma? • a csapatmunka hatásosabb • kevesebb enzim elég ugyanannyi kristályos cellulóz hidrolizálásához (szinergizmus) • a szabad enzim könnyebben eldiffundálhat • a C. thermocellum (celluloszóma) hatékonyabb a Trichoderma reeseinél (egyedi enzimek) • mesterséges celluloszómák: mesterséges polimerek lebontása (nylon, poliészter, műanyagok) • válogatott enzimek meghatározott helyre beépítve

25. Nem celluloszómás cellulázok • A termelő fajok gyakran több hasonló funkciójú cellulázt termelnek, melyek specifitása némileg eltér (a polimert más-más helyen hasítják) • Pl. T. reesei két exoglükanáz, 5 endoglükanáz.Cellulomonas sp. 6 endoglükanáz • Ezek az enzimek rendelkeznek cellulóz kötő doménnel • Thermobifida fusca faj érdekessége, hogy van egy olyan glükanáza, mely endo-, és exo aktivitással is bír

26. Észterázok,lipázok • Széles körben elterjedtek a természetben • Stabil enzimek, széles pH és hőmérséklet tartomány, stabilak szerves oldószerekben • Észterkötések hidrolizise: glicerinészterekből zsírsav és glicerid • Extracelluláris, indukálható enzimek, ált. gyengén lúgos környezetben, Ca ionok pozitív hatás (zsírsavak Ca sóként kicsapódnak, nincs termékgátlás), N forrás is befolyásolja termelődésüket • Hasznosítás: gyógyászat, élelmiszeripar (pl. sajtgyártás), tisztítószerek, bioüzemanyagok (biodízel) • Termelő fajok: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, egyes élesztőgombák, és Lactobacillus, Micrococcus baktériumok,emlős hasnyálmirigy, máj, magvakban

27. Aerob lebontási folyamatokban a központi szerepet az oxigenázok játszák • Alkánok, aromás vegyületek oxidációját katalizálják, melynek eredménye alkoholok, aldehidek, epoxidok, karboxilsavak • Ipari biotechnológiai jelentőség

28. OXIGENÁZOK • Működésükhöz molekuláris oxigénre, és kofaktorokra van szükség • szerkezetükben, működésükben, kofaktor igényükben eltérnek • Általában több alegységből állnak • Az általuk katalizált reakció energianyerő, de a keletkező energiát a sejt a szubsztrát szerkezet destabilizálására fordítja • 1955Osamuri Hayaishi - felfedezi az oxigenáz enzimeket dioxigenázok • H. S. Mason - felfedezi a fenoláz enzimet monooxigenázok • 1965- Irwin Gunsalus - citokróm P450 bakt. monoox. • 1970 David Gibson- aromás szénhidrogén dioxigenázok - lebontó útvonalak tanulmányozása • 1980- sok kutatócsoport - lebontási útvonalak feltérképezése • Ananda Chakrabarty - katabolikus plazmid transzfer Pseudomonas törzsek között

29. Az aromás gyűrű szerkezet lebontási útvonalában a Prokarióta és Eukarióta oxigenázok katalizálta reakciók első lépcsője

30. OXIGENÁZOK Nagyon eltérő szervezetekből származnak, mégis számos közös tulajdonságot fedezhetünk fel szerkezetükben, reakció mechanizmusukban Az oxigenázokat két nagy csoportba sorolják: monooxigenázok, dioxigenázok Az enzimreakció során a NAD(P)H-t az enzimen levő FAD oxidálja, a FADH2 kofaktorhoz kapcsolódik az O2, és egy reaktív hidroxiperoxiflavin tartalmú fehérje képződik. Majd egy átmeneti köztiterméken keresztül hidroxilálja az aromás gyűrűt.

31. OXIGENÁZOK • Számos szervezetben megtalálhatók • Gyakran plazmidon kódoltak • Szerkezetileg lehetnek hasonlóak, miközben funkciójukban eltérnek • Összefüggés a szubsztrát spektrum nagysága és a hatékonyság között (sok szubsztrátot elfogadó enzimek hatékonysága gyakran gyengébb) • Ipari hasznosítás –módosított enzimek: jobb hatékonyság, nagyobb szubsztrát spektrum

32. I. Monooxigenázok • Az O2 molekula egyik atomját építik be a célmolekulába, az oxigén másik atomja redukálódik és vízmolekulává alakul. Elektrondonorként NAD(P)H-t igényel, vagy magát a szubsztrátot használja • Többségük egykomponensű enzim, de előfordul multikomponensű is pl. fenol-, toluol monooxigenáz Csoportosításuk: 1. aromás gyűrű monooxigenázok 2. alkil csoport hidroxilázok 3. citokróm P-450 család 4. aromás aminosav hidroxilázok (Eukariótákban)

33. II. Dioxigenázok • A dioxigenázok az O2 mindkét atomját a szubsztrátba építik. Csoportosításuk: 1. Az aromás gyűrűre oxigént építő - mindig orto pozícióban dihidroxilálnak, katekol származék keletkezik - funkcionálisan két rész: egy hidroxiláz komponens és egy e- transzport komponens - A reakcióhoz NAD(P)H-ra is szükség van. 2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok - A gyűrűt hasító dioxigenázok az oxigén molekula két atomját úgy építik be a katekol származékokba, hogy közben a gyűrű felnyitását is katalizálják, külső reduktánsra nincs szükség - 2 v. több –OH csoportot tartalmazó aromás gyűrűk a szubsztrátjaik

34. II. Dioxigenázok 2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok • Ha a 2 –OH csop. egymáshoz visz. helyzete orto, akkor több pozícióban is hasíthatják a gyűrűt: megkülönböztetünk 2,3-; 3,4-; 4,5-gyűrű hasító dioxigenázokat: a, 2,3-; 4,5-dioxigenázok a katekolokat extradiol/meta, b, 3,4-dioxigenázok intradiol/orto helyzetben hasítják - Ha a 2 –OH csop. egymáshoz visz. helyzete para pl. gentizát esetén a karboxil csoport és a mellette lévő hidroxil csoport között hasít

35. II. Dioxigenázok 2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok NADH+H+NAD+ • orto/intradiol hasító dioxigenázok a két hidroxil csoport között nyitják a gyűrűt, mukonát intermedieren keresztül szukcinát keletkezik • meta/extradiol hasító dioxigenázok a két hidroxil csoport mellett hasítanak, hidroxi-szemialdehid intermedieren keresztül piruvát keletkezik O2YH