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MAXIMAL METHODISCH

MAXIMAL METHODISCH. im INTRAnet: tmikpoh.charite.de/methods. DNA-Sequenzierung. MAXIMAL METHODISCH Das Methodenseminar 25.07.2005 Lena Wronski. Methoden. Kettenabbruchmethode nach Sanger Maxam-Gilbert-Methode Sequenzierung durch Hybridisierung. Methoden.

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MAXIMAL METHODISCH

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Presentation Transcript

  1. MAXIMAL METHODISCH im INTRAnet: tmikpoh.charite.de/methods Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  2. DNA-Sequenzierung MAXIMAL METHODISCH Das Methodenseminar 25.07.2005 Lena Wronski

  3. Methoden Kettenabbruchmethode nach Sanger Maxam-Gilbert-Methode Sequenzierung durch Hybridisierung Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  4. Methoden Kettenabbruchmethode nach Sanger Maxam-Gilbert-Methode Sequenzierung durch Hybridisierung Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  5. Prinzip enzymatische Neusynthese von DNA Analyse der neusynthetisierten DNA Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  6. Prinzips des Kettenabruchs Bausteine der DNA-Neusynthese: dNTPs (N= A, C, G oder T) Sequenzreaktion: ddNTPS im Reaktionsmix bei Einbau keine Verlängerung durch Polymerase Kettenabbruch Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  7. ddNTPs Didesoxyribunukleosidiphopsphate Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  8. Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  9. Markierung des Abbruchpunktes Markierung des Primers Markierung der ddNTPs • radioaktiv • mit Fluoreszenzfarbstoffen (DyeTerminatoren) Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  10. Vorteile der DyeTerminatoren • One-Tube Reaktionen • keine Termination sites • keine markierten Primer nötig • Verhältnis dNTPs/ddNTPs bestimmt Sequenzlänge • direkte Sequenzierung von PCR-Produkten möglich Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  11. Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  12. Auftrennung der entstandenen Fragmente durch Gelelektrophorese Kleine DNA-Fragmente laufen schnell, größere bleiben zurück Vorteil der Laserdetektion: Endpunktdetektion größere Fragmente können noch unterschieden werden lesbare Sequenzlänge nimmt zu Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  13. Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  14. Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  15. Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  16. Ablauf • DNA-Präparation • (PCR) • Aufreinigung des Produkts • Sequenzreaktion • Aufreinigung • Sequenzierung • Datenauswertung Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  17. DNA-Präparation • Qualität WICHTIG • unbedingt Kit-Protokollen folgen • Quantität WICHTIG • Photometer • Gelabschätzung Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  18. Aufreinigung von PCR-Produkten Abtrennung von überschüssigen Primern, dNTPs, Salzen • Gelsäulen (z.b.QiaQuick PCR-Purification Kit) • Verdau mit SAP und Exo1 • Gelelution • Fällung: 4M Ammoniumacetat • Filtermembran (Centricon, Microcon) Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  19. Sequenzierprimer • 22-24mer • Bindungsstelle ca 50bp vor der eigentl.Sequenz • Basenzusammensetzung ausgewogen • G/C-Gehalt ~50% • 3‘Ende: G oder C • Tm >50°C • evtl PCR-Primer übernehmen? Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  20. Möglichst vermeiden: • Primer-Dimere • Sekundäre Bindungsstellen • Sekundärstrukturen • Repeats Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  21. Template-Menge Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  22. Reaktionsansatz Sequenzier-PCR Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  23. Aufreinigung nach Sequenzierreakton • Spin Column/Plate Zeit zwischen Herstellung und Verwendung? Ladevolumen? Zentrifuge, Parameter? • Fällung Temperatur? Zentrifugation? Mischen? Ethanolreste vermeiden! Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  24. Auswertung • DNA-Star, Sequence Analysis • Sequencher • Freeware: CHROMAS (http://www.technelysium.com.au/chromas.html) AbiView (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/abiview/abiview.html Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  25. Gute Daten Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  26. Basecalling Algorithmus zur „Filterung der Rohdaten“ Achtung! Basecaller und DyeSet müssen zusammenpassen! Dyeset richtet sich nach Art des DyeTerminator Mix! Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  27. Chromatogramm Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  28. Annotations • Anmerkungen des Analyseprogramms zu Signalstärke, Lauflänge Spacing (Abstand der einzelnen Signale) Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  29. Troublesdie häufigsten Phänomene • DNA Template-Menge • zu viel • zu wenig • Template-Qualität • Kontaminationen • Inhibitoren • Salze Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  30. Troubles die häufigsten Phänomene • Primerqualität Restprimer Primer-Dimere Qualität (Alter? wie oft schon verwendet? Wie oft aufgetaut/eingefroren?) Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  31. TroubleshootingParameter zur Problemerkennung Chromatogramm Signalbild Hintergrund (Rauschen Reichweite Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  32. TroubleshootingParameter zur Problemerkennung Rohdaten Intensitäten unspezifische Signale Annotations relative Signalstärke Spacing Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  33. Zur Erinnerung – so sehen gute Rohdaten aus Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  34. Sequenzreaktion fehlgeschlagen Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  35. Zu viel Template Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  36. Zu viel Template Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  37. Zu wenig Template Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  38. Gemischte Sequenzen -mehrere Templates im Ansatz -mehrfache Primerbindungsstellen Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  39. Kontamination durch mangelhafte Aufreinigung Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  40. Mangelnde Aufreinigung Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  41. Rascher Signalverlust GC-/GT-reiche Regionen, Sekundärstrukturen vorhanden Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  42. Dye Blobs zu wenig Template/Kontaminationen, die Dye-Klumpen bilden Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  43. Slippage/“Abrutschen“ Sequenz enthält Repeats, Polymerase „rutscht aus“ Maximal Methodisch - das Methodenseminar

  44. Maximal Methodisch - das Methodenseminar

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