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Prof. Odir A. Dellagostin

Biblioteca Genômica e de cDNA. Prof. Odir A. Dellagostin. Biblioteca Genômica. É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo. Características das Bibliotecas de DNA . São usadas para principalmente para procariotos

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Presentation Transcript

  1. Biblioteca Genômica e de cDNA Prof. Odir A. Dellagostin

  2. Biblioteca Genômica • É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo

  3. Características das Bibliotecas de DNA • São usadas para principalmente para procariotos • Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras • Independe do típo de célula utilizada para a obtenção do DNA

  4. Biblioteca de cDNA • É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA. • É usada principalmente para células eucarióticas. • Varia de acordo com o tecido utilizado.

  5. Etapas na construção de uma Biblioteca

  6. Bacteriófagos Bacteriófagos

  7. Cosmídios

  8. É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens diferentes • Hibridização  Renaturação HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

  9. Aplicações • Triagem de Bibliotecas Genômicas • Diagnóstico molecular • Tipagem molecular • Teste de paternidade • Medicina forense

  10. Sonda de DNA Utilizar sonda de oligonucleotídeos derivado de uma proteína Anticorpos Conhecer parte da seqüência do gene Codon degenerado Conhecer cerca de 6 aa contíguos Seqüência completa do gene Triagem de uma biblioteca

  11. 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

  12. SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada • Marcação da Sonda de DNA • Radioativa: 32P • Não radioativa: peroxidase, fosfatase alcalina

  13. Marcação da Sonda de DNA • Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalina Desnaturação DNA DNA fita simples + peroxidase complexada com polimero positivo Ligação Fraca (DNA+ Peroxidase) + glutaraldeído Sondas Covalentemente marcada com a enzima

  14. 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização Placas com Colônias contendo os plasmídeos Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA 1 3 2 4 6 5 Sonda Filme de Raio - X

  15. 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

  16. Caracterização da seqüência encontrada • Seqüenciamento de DNA • PCR • Expressão da seqüência codificadora

  17. Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western Blot - Proteína

  18. Southern Blot • Sonda: seqüência de DNA marcada Transferência de DNA do gel para a membrana

  19. NORTHERN BLOT 1. Extração do DNA 4. Geração de uma sonda marcada dATP dGTP dTTP dCTP pGEM-T 2. Eletroforese do RNA 5. Hibridização 6. Visualização 3. Transferência para a menbrana

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