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Transformaci ón

Transformaci ón. Ingreso a la célula de DNA presente en el medio. Bacterias Levaduras Células de animales (mamíferos) Células vegetales. Bacterias ( Escherichia coli ) Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma

rashad-campos
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Transformaci ón

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Presentation Transcript

  1. Transformación Ingreso a la célula de DNA presente en el medio Bacterias Levaduras Células de animales (mamíferos) Células vegetales

  2. Bacterias (Escherichia coli) • Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma • Plásmidos manipulados por ingeniería genética: vectores de clonamiento • ►Origen de replicación • ►Gen de resistencia a antibiótico (marcador de transformación) • ►Sitio de clonamiento (“polylinker”) • Transformación (transfección) llevada a cabo por: • Permeabilización con CaCl2, choque de temperatura • Electroporación • Utilidad • ►Biblioteca de cDNA - sitio de clonamiento asociado a gen de -galactosidasa • ►Expresión de proteínas recombinantes - sitio de clonamiento asociado a operón • lac (expresión inducible por IPTG) y elemento que facilite purificación (ej. His-tag)

  3. X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) -galactosidasa H HO Producto azúl galactosa Colonias azules : fragmento clonado Colonias blancas : sin fragmento - IPTG → expresión bloqueada + IPTG → expresión

  4. Levaduras (Saccharomyces cerevisiae) Plásmidos→ del tipo lanzadera (“shuttle”) ► Origen de replicación en E. coli ► Gen de resistencia a antibiótico (selección en E.coli) ► Origen de replicación en levadura ● 2  ● ARS (secuencia de replicación autónoma) ► Marcador de selección metabólico YACs → Cromosomas artificiales de levadura ► Secuencias teloméricas ► Secuencias centroméricas ► Marcador de selección metabólico ► ARS (secuencia de replicación autónoma)

  5. Vectores y marcadores de selección en levaduras (YAC)

  6. Transformación llevada a cabo por: 1. Generación de esferoplastos, permeabilización con CaCl2, choque de temperatura 2. Tratamiento con acetato de litio y PEG, choque de temperatura Utilidad ► Expresión de proteínas recombinantes que no se pliegan correctamente en E. coli ► Clonamiento de fragmentos muy grandes para el estudio de genomas complejos (YACs) ► Genes de levadura → similitud con genes de animales y plantas superiores Levadura útil como modelo para probar función de genes de otros organismos

  7. Manipulación de genes por recombinación homóloga

  8. Eliminación (KO) de genes cromosómicos

  9. KOTPK1, TPK2, TPK3 “Plasmid shuffle” Estudio de función de genes mutantes o genes foráneos

  10. Interacción de proteínas por ensayo de doble híbrido

  11. Animales Genes en: ► Fragmentos de DNA ► Vectores tipo plásmido con elementos virales ► Virus Fragmentos y vectores que no se replican → Transitoria Permanente (integración) Vectores que se replican y virus → Genomas extracromosómicos independientes Partículas virales

  12. Transformación llevada a cabo por: Microinyección DNA precipitado con fosfato de calcio (endocitosis) Electroporación Liposomas Infección viral Utilidad ► Expresión de proteínas recombinantes ► Estudio de la expresión de genes en entorno natural (promotor + gen reportero) ► Estudio de la función de los genes en entorno natural ● Expresión ● Silenciamiento (antisentido)

  13. Marcadores de selección

  14. Ejemplo 1: Transformación con fragmentos de DNA

  15. Ejemplo 2: Transformación con vectores

  16. Localización de HBZ-GFP y HBZ-SI-GFP en células COS7 Murata et al. J. Virol. 80(5): 2495-2505 (2006) Vector: pcDNA3/HBZ-GFP pcDNA3/HBX-SI-GFP

  17. Ejemplo 3: Transformación combinada fragmentos de DNA y virus

  18. Ejemplo 4: Transformación combinada fragmentos de DNA y virus

  19. Ejemplo 5: Transformación con virus (retrovirus)

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