Le Transcriptome

1. Le Transcriptome • Introduction • Méthodes d’analyse du transcriptome • Puces à ADN : principe et méthodologie • PCR en temps réel

2. Vérification et validation des résultats microarraysApport de la PCR en temps réel

3. Intérêt de la PCR quantitative en temps réel : Rappel de l ’équation de la PCR N = N0 ( 1 + E )n • Avec • N0 : la quantité initiale de cible d’ADN • E : efficacité de la PCR (E =1 dans le meilleur des mondes) • n : le nombre de cycles d ’amplification • N : la quantité de produit de PCR

4. PCR quantitative: permet une mesure directe de la réaction au cours de l ’amplification 1+E N N = N0 ( 1 + E )n théorie Log ADN cible expérimental • Effet Plateau • Dénaturation TAQ • PPi inhibiteur • Compétition/ réhybridation N0 n Nombres de cycles

5. Domaine de quantification en PCR classique Echantillon A Log ADN cible Echantillon B PCR temps réel Nombres de cycles

6. Echantillon A Log ADN cible Echantillon B Seuil de détection (Threshold) Ligne de base Ct B Ct A Nombres de cycles Cuting Threshold = Ct

7. Amplification du même échantillon distribué dans une microplaque de 96 puits • Entrée simultanée en phase linéaire (Ct identiques) • Quantités finales de fluorescence sont très différentes

8. Ct est corrélé au nombre de copies initiales d ’ADN cible • Si on a 2 fois plus d’ADN initial , le Ct est inférieur d’un cycle (si E=1) • Il existe une relation linéaire entre le log du nombre de copies initiales et le cycle seuil sur au moins 6 logs Il y avait 256 fois plus de cibles dans l’échantillon B9 que dans B8 (Si E=1) B8 B9 ΔCt=8

9. Amplification du gène de la beta-actine(dilutions en séries avec un facteur 2)

10. Le Ct permet de déterminer le nombre de copies initiales

11. A Quoi ça ressemble ? iCycler iQ

12. Les systèmes de détection les plus courants • Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le Sybergreen. • Les sondes Taqman

13. Les systèmes de détection les plus courants • Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le SyberGreen. • Les sondes Taqman

14. SB SB SB SB SB SB SB SB 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Taq 5’ 3’ SB Taq 3’ 5’ SB 5’ SB SB 3’ 5’ Elongation UV Taq 5’ 3’ SB SB SB 5’ 5’ SB SB SB Taq 3’ Mesure: à la fin de l’étape d’élongation

15. Vérification de la spécificité des amplifiats: utilisation des courbes de fusion • Pourquoi? En SB, tous les fragments d’ADN doubles brins générés, spécifiques ou non, donneront un signal • Programmer une courbe de fusion: 1 cycle avec une augmentation lente de la température pour permettre le passage de la totalité de l ’ADNds en ADNss • Cette température, Tm, est caractéristique de l ’ADN et renseigne sur la séquence de l ’ADN sans directement le séquencer • Pour cela on exploite le fait que le SYBR Green fluoresce environ 250 fois plus quand il est lié au double brin d ’ADN. Quand la température augmente, les doubles brins disparaissent et la fluorescence diminue. Identification des produits non spécifiques: - primers-dimers - amplicons non spécifiques

16. Exemple de courbe de fusion Vous pouvez suivre en direct la diminution de la fluorescence quand la température augmente (Real Time!)

17. Courbes de fusion: utilisation de la dérivée (-dF/dT) Tm Deux Tm indiquent la présence d’au moins deux fragments d’ADN ( le + souvent Tm1= dimères de primers) Tm1 Tm2

18. Les systèmes de détection les plus courants • Agent intercalant comme le bromure d’éthidium: le Sybergreen. • Les sondes Taqman

19. Sonde TaqMan Principe: Lors de la PCR, 3 oligonucléotides simples brins sont ajoutés au milieu réactionnel • Les deux amorces permettant l’amplification (amorce directe et amorce inverse complémentaire • Une sonde qui peut s’hybrider sur une séquence correspondant au produit de PCR amplifié (spécificité!!) La sonde contient deux fluorophores: un reporter qui est excité par le laser, et un quencher dont la longueur d’onde d’excitation correspond à la longueur d’onde d’émission du reporter. Lorsque les deux fluorophores sont à proximité, le quencher absorbe la fluorescence du reporter. 570 nm 488 nm 520 nm Reporter Quencher Fluorescéine ou FAM 5 ’ TAMRA 3 ’

20. 488 nm 570 nm Pendant la PCR, la sonde s’hybride sur l’ADN simple brin lors de l’étape d’hybridation des amorces FAM Hybridation TAMRA 5’ 3’ 3’ 5’ 488 nm 570 nm Taq: ADN polymérase 5’-3’ et Activité Exonucléase 5’-3’ Elongation 3’ 5’ 488 nm 520 nm Mesure à la fin de l’étape d’élongation 5’

21. FAM TET, VIC BHQ-1 DABCYL HEX JOE Eclipse CY3 TAMRA TAMRA QSY-7 CY3.5, Redmond Red Texas Red, ROX BHQ-2 CY5 LC640 BHQ-3 CY5.5 LC705 Choix du quencher Fluorophores: Quenchers: