Programa de Pós-Graduação em Genética/UFMG

1. Programa de Pós-Graduação em Genética/UFMG Estudos de domínios reguladores de transcrição de proteínas Tead com novas tecnologias genéticas Erica Maria de Queiroz Orientador: José Miguel Ortega Laboratório de Biodados, Biologia Celular e Desenvolvimento

2. Introdução • As proteínas Tead • domínio TEA (90% conservado) • estrutura 3D • homologia: camundongos (Tead1, 2, 3, 4) galináceos (TEF-1A, B, C e D) Drosophila (SD) Aspergilus nidulans (Aba A) leveduras (TEC-1)

3. Proteínas mTead: Função no desenvolvimento: mTead1 (,  e ) coração/ músculo mTead2neurônios/ rins mTead3placenta/ músculo/ coração / pulmões/ rins/ intestino mTead4 (4a e 4b)pulmões/músculo esquelético • Introdução • 4 parálogos (camundongos): • expressão estágios embrionários: pré-implantação/ final adulto

4. Proteínas: Função: Referências: YAP65 co-ativador transcricional DePamphilis et al., 2001 Max fosfoproteína nuclear Gupta et al., 1997 TBP proteína de ligação a TATA box Jiang et al., 1996 TONDU/hVgl-1, hVgl-2 e hVgl-3 co-ativadores transcricionais Vaudin et al., 1999 MEF2 fator de transcrição de soro Stewart et al., 2002 SRF fator de transcrição de miócito Gupta et al., 2001 PARP modificador de histonas Ordahl et al., 1999 P160 (SRC1,TIF2 e RAC3) co-ativadores nucleares Parker et al., 2000 • Introdução • especificidade de ativação e repressão de diferentes genes • interações com outras proteínas

5. NAD TEA PR STY ZF - - - +++ PROMOTOR PROMOTOR PROMOTOR 134 236 342 426 52 • Introdução • A proteína mTead1 • 99% de homologia a Tead1 humana • domínios caracterizados Rodrigues, 2001

6. Objetivo Geral Desenvolver e aplicar tecnologias genéticas para o estudo de domínios reguladores da transcrição gênica utilizando proteínas Tead como modelo

7. Objetivos Específicos • Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead • Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA • Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido • Triagem de uma biblioteca de cDNA de embrião de camundongo de 7 dias utilizando PR e ZF como “isca” • Aplicar nova tecnologia de análise de alteração da proliferação celular para verificar a atuação de mTead4 na regulação do ciclo celular • Objetivos Específicos • Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead • Isolar mutantes de mTead1: N-terminalN-terminal + TEA • Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido

8. Metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido

9. Proteína 2 Proteína 1 DA DL Gene Repórter HIS3 UASGal mRNA Sistema de Duplo-Híbrido

10. Proteínas: Referências: SNF1 / SNF4 Fields et al., 1989 Proteínas cinases de SNF1 Yang et al., 1992 SRF / SAP1 Dalton et al., 1992 RAP1 / RIF 1 Hardy, 1992 C-jun / c-fos Katoet al., 1992 Maize B / maize C1 Goff et al., 1992 HIV gag / ciclofilina A e B Luban et al., 1993 Max / Mxi 1 Zervos et al., 1993 Rb / proteína fosfatase tipo 1 Durfee et al., 1993 Ras / Raf van Aelst et al., 1993 p53 / antígeno-T Li & Fields, 1993 Grb2 / Sos1 Chardin et al., 1993 várias proteínas hélice-alça-hélice Standinger et al., 1993 DBF4 / CDC7 Jackson, 1993 Interações detectadas com o sistema de Duplo-Híbrido

11. A Proposta Modelo Deepwell Seleção em Meio Líquido Modelo Erlenmayer

12. 108células/ml Transformação com LiAc trp leu Inóculo 0,5.107células/ml Seleção em meio sólido Seleção em meio líquido 104 transformantes não transformantes transformantes duplo-híbrido positivo <1 “duplo-híbrido” n X -trp –leu -his 3AT -trp -leu Transformação em Leveduras Seleção

13. Seleção em Meio Líquido: Elaborando o Protocolo

14. largeT p53 GAD GBD • Adição de Gal4DA-largeT • 0 ng • 0,1 ng • 1 ng • 10 ng • 100 ng • Adição de Gal4DA-largeT • 0 ng • 0,1 ng • 1 ng • 10 ng • 100 ng Gal4DL-p53 (1 g) + Gal4DA (1 g) GAD Metodologia Elaborando o protocolo

15. dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 -trp –leu (1+1+1) 1:10 1:100 OD -trp –leu -his Transformação (2+1+1) 1:10 1:100 OD -trp –leu –his 0,1mM 3AT (2+1+2) 1:10 1:100 OD -trp –leu –his 0,5mM 3AT (3+1+1) 1:10 1:100 OD Metodologia Os 4 experimentos

16. Resultados Preliminares

17. 0 0,5 0,8 44,5 119,3 1+1+1 Resultados Preliminares transformantes em placa

18. 0 0,5 0,8 44,5 119,3 2+1+1 Resultados Preliminares transformantes em placa

19. 0 0,5 0,8 44,5 119,3 2+1+2 Resultados Preliminares transformantes em placa

20. 0 0,5 0,8 44,5 119,3 3+1+1 Resultados Preliminares transformantes em placa

21. Transformação OD =600 nm Diluição 1:10 Diluição 1:100 3° dia ON 30°C 4° dia ON 30°C 5° dia 1° dia Sumarizando O protocolo

22. Seleção em Meio Líquido: Modificando o Protocolo

23. Transformações Gal4DL-p53 Gal4DA 100 ngGal4DA-largeT Gal4DL-p53 Gal4DA 100 ngGal4DA-largeT Gal4DL-p53 Gal4DA Gal4DL-p53 Gal4DA 436l 4,36l 21,8l 43,8l 10,9 ml –trp –leu -his 1 ng 0 ng 5 ng 10 ng Metodologia Modelo Deepwell

24. Gal4DL-p53(1 g)+ Gal4DA(1 g) Gal4DA-largeT Modelo Deepwell 0 ng 1 ng 5 ng 10 ng controle Metodologia Modelo Deepwell 4 placas grandes = 1 deepwell

25. Resultados Preliminares Modelo Deepwell % poços com crescimento % 22 setores em placas [pTD1] (ng)

26. pGBT9, pVA3, pVA3* + pTD1 - p53 p53mut transformação, diluições com seleção em 3-aminotriazol 1 pVA3 : 3 pVA3* enriquecimento pVA3 Perspectivas Modelo Erlenmayer

27. amplicon p53 p53mut Construção GBD-p53 GBD-p53mut GBD Proteína p53 p53mut - Interação forte fraca não Perspectivas

28. Isolamento de mutantes do domínio N-terminal de mTead1

29. Proteína GBD CAN1 / LacZ UASGal mRNA Sistema de Mono-Híbrido Reverso MORTE / AZUL

30. Domínio ativador GBD Não = GBD compete? Sistema L-can Sim = domínio ativador plasmídio 100% Sobrevivência domínio ativador? GBD?? 0,2% [L-can] Starling, 2000

31. Proteína GBD GAD GBD Ensaio de Competição contra Gal4p inteira Gal4p mais expressa = cor azul pCL1 (Gal4p) + Competidor (contém GBD) Co-transformação (repórter LacZ) GBD competidor mais expresso = Leveduras brancas (domínio ativador mutado, GBD não) Gal4p X Gene Repórter LacZ UASGal

32. 29% 62% 80% Relação entre plasmídio competidor X pCL1 (Gal4p) e porcentagem de colônias azuis em ensaio com X-gal Gonçalves, 2003

33. N-terminal mTead1/4 GBD meio seletivo L-canavanina colônia individual 105 células/ml Transformação YJOZcanR -w -ura ON 30°C Metodologia Sistema de Mono-Híbrido Reverso Gene repórter = transportador de L-arginina/L-canavanina (tóxica) A seleção

34. Obrigada!