Protein De-Novo Design

1. Mooli Tayer, Assaf Faragy Advised by Dr. Ora Furman-Schueler Protein De-Novo Design

2. אז מה יהיה לנו היום? • בעיית החיזוי והתוויית דרך לפתרון חישובי • Rosetta and the it’s Unified Framework • Computational redesign of DNA endonuclease • Kemp elimination catalysts by computational enzyme design

3. בעיית חיזוי מבנה מבנה רצף

4. בעיית החיזוי • הנחה: המבנה הנטיבי הוא המצב האנרגטי הנמוך ביותר של החלבון. • גישה נאיבית • Levinthal Paradox • 10143

5. בעיית החיזוי: מבט שני • תהא X קבוצת המבנים האפשריים לרצף הנתון. • תהא f: X→Rפונקציית אנרגיה. • רוצים למצוא את Min f(x) לכל xX.

6. מצרכים לפתרון • פונקציית אנרגיה • שיטת דגימה (Sampling Method) • כוח חישוב

7. אלגוריתם Rosetta • פרוייקט משותף של מעבדות רבות • TOP7 • The Baker lab, University of Washington

8. פונקציית האנרגיה שיקולים אנרגטיים: • קשרי מימן • אריזה צפופה • האפקט ההידרופובי • מודל קשרי מימן מפורש • Lennard-Jones potential • Implicit solvation model

9. סכימה בפונקציית האנרגיה • דיברנו על מחיר לאינטראקציות בודדות. • הסכימה נעשית בשני שלבים: • סכימה עבור אפקט ספציפי (למשל קשרי מימן): • סכימה עבור סה"כ המרכיבים : חסרונות

10. שיקולי רזולוציה Energy Conformations Global minimum

11. שיקולי רזולוציה • שני שלבים ברזולוציה משתנה:

12. Sampling Method • אתחול שיירים בערכים מצויים • בחירת קונפורמציות מקומיות מועדפות (Fragment libraries)

13. Sampling Method: Refinement • Simulated annealing search (Backbone-dependent rotamer library) • שימוש בפרוטוקול Monte-Carlo רב-שלבי.

14. כוח חישוב: Rosetta@home • שיתוף פעולה אקדמי-קהילתי • BOINC distributed computing Google, YouTube & download: • Rosetta@home • BOINC

15. בעיית החיזוי והתוויית דרך לפתרון חישובי • Rosetta and the it’s Unified Framework • Computational redesign of DNA endonuclease • Kemp elimination catalysts by computational enzyme design

16. ומה עם בעיות אחרות? • בעיות שכנות עם מאפיינים משותפים +

17. יתרונות של מסגרת אחידה • חיסכון גדול בעבודה • פידבק מקבוצות שונות  שיפור האלגוריתם • גילוי פגמים ומגבלות

18. בעיות חיזוי a Protein structure prediction b Loop modeling

19. בעיות חיזוי "... כך סתם פגש חלבון את חלבון, בחום היפה, באור הנכון, ומהם יצא חלבון עם כשרון... והתכשיט כבר יודע לעשות חשבון!"

20. בעיית חיזוי מבנה מבנה רצף

21. בעיות תכנון

22. בעיות תכנון

23. מגבלות ואתגרים • מרחב החיפוש גדל אקספוננציאלית כתלות בדרגות החופש. • קושי במידול אינטראקציות פולריות, אנטרופיה • אוטומציה (Robetta) • פיתוח פונקציית אנרגיה לRNA

24. בעיית החיזוי והתוויית דרך לפתרון חישובי • Rosetta and the it’s Unified Framework • Computational redesign of DNA endonuclease • Kemp elimination catalysts by computational enzyme design

25. Computational redesign of endonuclease DNA binding and cleavage specificity • ברצוננו ליצור אנזים חדש השונה מגזע הבר בשתי תכונות: • נקשר לאתר מטרה חדש • אינו נקשר לאתר הישן • ודומה לו בשתי תכונות: • חיתוך • הבחנה

26. ברצוננו ליצור אנזים חדש השונה מגזע הבר בשתי תכונות: • נקשר לאתר מטרה חדש • אינו נקשר לאתר הישן • ודומה לו בשתי תכונות: • חיתוך • הבחנה

27. I – MsoI שייך למשפחת אנזמי ה-LAGLIDADG. אנזים הומודימרי בעל 170 חומצות אמינו חותך אזורים באורך 20-24 זוגות בסיסים בספציפיות גבוהה. מקודד באינטרון (???)

28. תוכנית פעולה

29. שלב מקדים

30. תוכנית פעולה

31. שלב א – פגיעה בקישור אנזים דנ"א העלות האנרגטית של אובדן קשרי המימן וdesolvation של ליזין 28: +3.2kcal/mol. קשר מימן של הפורין (G ב6- וA ב6+)עם ליזין 28 של החלבון. קשר בתיווך מים עם תראונין.

32. Figure S2. b) Hydrogen bonding energy between protein and DNA basepairs, not including the DNA phosphate backbone/

33. תוכנית פעולה

34. התאמת חלבון לאתר החדש • ארגינין 83 צפוי לעשות שני קשרי מימן עם הצמד G-C. • לאוצין 28 מעלה את אנרגיית הקישור לדנ"א W.T (ובכך משבשת אותו)ומבצע אינטראקציה עם פחמן 5 של C בדנ"א המוטנטי.

35. תוצאות

36. תוצאות

37. תוצאות

38. Competitive in vitro cleavage assays –W.T • במבחנה: דנ"א W.T , דנ"א מוטננטי, 8.3kb של דנ"א לא ספציפי, I-MsoIמוטנטיאוW.TI-MsoI .

39. Competitive in vitro cleavage assays • הבחנה של הW.T > 32.(בין שני האתרים) • הבחנה של ה DES ≈ 16. • W.T חותך אתר מטרה בספצפיות >27 (ביחס לדנ"א כללי) • DES חותך אתר מטרה בספצפיות >25

40. DNA – Protein complexes

41. השלכות • נקודת פתיחה טובה ליצירה של אנזימים המכוונים לאתרים ספצפיים לצורך שימושים בגנומיקה ובריפוי גנטי. • המחקר מציג התקדמות משמעותית בתכנון אינטראקציית חלבון דנ"א בעזרת מודל חישובי היורד לרמה האטומית. • הכללה לממשקי דנ"א חלבון כללים: • TF • (ZFNs)

42. בעיית החיזוי והתוויית דרך לפתרון חישובי • Rosetta and the it’s Unified Framework • Computational redesign of DNA endonuclease • Kemp elimination catalysts by computational enzyme design

43. Kemp elimination catalysts by computational enzyme design Röthlisberger D et al, 2008, Nature 453 190-5

45. Kemp elimination • לא ידועים זרזים טבעיים! • צעד קובע-קצב בריאקציות רבות מצב מעבר

46. שני מנגנוני קטליזה: Glu/Asp base His base, polarized by Glu/Asp

47. שני מנגנוני קטליזה: Glu/Asp base His base, polarized by Glu/Asp

48. חיפוש מארח • חלבון קיים, קושר ליגנד • שלד קשיח • גיאומטריה ומאפיינים מבניים

49. RosettaMatch • נדרשה התאמה של האלגוריתם לטיפול בשיירים • יותר מ 100,000 מארחים אפשריים • התאמה של כל מארח ברמת השיירים לייצוב מצב המעבר

50. KE59 catalytic site in Rasmol