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Méthodes de séquençage d’ADN

Méthodes de séquençage d’ADN. Rappel : ADN, Clonage, Électrophorèse Méthode chimique de Maxam et Gilbert Méthode enzymatique de Sanger Détails des techniques utilisées au début des années 1990 Séquençage de grands fragments : marche sur le chromosome, sous-clonage, etc. Automatisation

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Méthodes de séquençage d’ADN

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Presentation Transcript

  1. Méthodes de séquençage d’ADN • Rappel : ADN, Clonage, Électrophorèse • Méthode chimique de Maxam et Gilbert • Méthode enzymatique de Sanger • Détails des techniques utilisées au début des années 1990 • Séquençage de grands fragments : marche sur le chromosome, sous-clonage, etc. • Automatisation • Méthode Shotgun BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  2. Rappel sur l’ADN Désoxyribose Base azotée Phosphate http://www.dgpc.ulaval.ca/bio90192/chap4/notesadn/notesadn1.htm BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  3. Enzymes de restriction http://www.dil.univ-mrs.fr/~vancan/optionBio1/documents/1ercours2003_4.pdf BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  4. Clonage d’ADN http://www.sesep.uvsq.fr/formation/strucplasm.JPEG BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  5. Clonage d’ADN http://www.sesep.uvsq.fr/formation/princlon1.JPEG http://www.fhcrc.org/education/courses/cancer_course/basic/approaches/screening.html BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  6. Principe de l’électrophorèse http://www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/techgen/html/electro.htm BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  7. Exemple d’électrophorèse BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  8. Méthode de Maxam et Gilbert BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  9. Méthode de Maxam et Gilbert BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  10. Méthode de Maxam et Gilbert BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  11. ADN polymérase 5’ 3’ BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  12. Méthode de Sanger http://www.finnzymes.fi/products/pcr/phusion_high_fidelity_dna_polymerase.htm BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  13. Méthode de Sanger • Préparation d’une grande quantité d’ADN (~1mg via miniprep)Dénaturation et ajoût de l’amorce, des 4 dNTP (dont 1 radioactif, S35 ou P32) et de l’ADN polyméraseFaire 4 aliquots et mettre un peu de ddNTP dans chaque tubeElongation et terminaison par incorporation de didéoxynucléotides spécifiques BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  14. Méthode de Sanger ddG ddA ddT ddC • Préparation du gel du polyacrylamideDénaturation et dépôt sur gelMigration par électrophorèse BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  15. Méthode de Sanger • Transfert du gel sur papier filtre (Whatman 3MM)Séchage du gelCassette autoradiographique (+ écran amplificateur)Développement du film autoradiographiqueLecture sur table lumineuseSaisie sur ordinateur Longueur typique de lecture : 400 nucléotidesDurée totale de l’expérience : environ 3 jours BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  16. Séquençage de grands fragments 10 kpb Marche sur le chromosome Synthèse de 2 * 10 amorcesDurée totale du séquençage : > 11 * 3 joursQualité des séquences  Lecture double brin  ~ 3 mois BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  17. PstI PstI SmaI SmaI BamHI EcoRI BamHI BamHI BamHI BamHI BamHI BamHI Séquençage de grands fragments 10 kpb Sous-clonage SmaI ~ 5 enzymes de restriction à 6 nucléotides (HindIII, EcoRI, BamHI, PstI, SmaI)Carte de restriction pour décider quelles enzymes retenirSous-clonage avec BamHI des 8 fragments Durée totale du séquençage : ~ 5 * 3 jours BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  18. Séquençage de grands fragments 10 kpb Polylinker Insert Plasmide 2 enzymes de restriction (5’ sortant et 5’ rentrant) Digestion avec une exonucléase ……… Prélévements toutes les ~30’’, ligation, clonage, séquençage  ~10 jours BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  19. Temps, coûts, difficulté de robotiser : Obtention de l’ADN (miniprep) Autoradiographie : 12h à des jours Couler les gels Détermination et fabrication des amorces (marche sur le chromosome) Sous-clonage Étapes limitantes du séquençage BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  20. Polymerase Chain Reaction PCR http://www.rit.edu/~gtfsbi/IntroBiol/images/CH11/figure-11-21.jpg BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  21. Utilisation des fluorochromes Cycle sequencing http://www.bioteach.ubc.ca/Bioinformatics/GenomeProjects/ BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  22. Utilisation des fluorochromes http://www.genotype.de/d/p/d_gel_plasmid_prep.htm BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  23. Capillaires http://www.genomenewsnetwork.org/resources/whats_a_genome/Chp2_2.shtml http://www.aecom.yu.edu/cancer/new/cores/sequencing/abi3700.htm BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  24. Séquençage par shotgun http://www.kisac.ki.se/education/slides/data/genomedbs/shotgun.html BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  25. Séquençage par shotgun BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  26. Evolution de la vitesse de séquençage BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

  27. Construction d’une carte de restriction http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics980211.html BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

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