Biomonitoring stanu środowiska

1. Biomonitoring stanu środowiska

2. Biomonitoring Bioindykatory – organizmy używane jako wskaźniki stanu środowiska Biomarkery – składniki materii ożywionej (najczęściej biomakromolekuły) używane jako elementy układów analizujących stan środowiska Biosensory – wyizolowane biomarkery wbudowane w układy pomiarowe

3. Bioindykatory • Organizmy, które wykorzystuje się do identyfikacji i pomiaru wpływu • polutantów na stan środowiska. • Cechy dobrego bioindykatora: • gatunek szeroko rozpowszechniony • w niewielkim stopniu mobilny • dostępny przez cały rok • łatwy do zbierania • charakteryzujący się wysokim współczynnikiem zatężania polutanta • wrażliwy na działanie polutanta

4. Przykłady bioindykatorów

5. Biomarkery Ilościowe wskaźniki zmian zachodzących w systemach biologicznych w odpowiedzi na pojawienie się w środowisku ksenobiotyków. Biomarkery mogą mieć charakter biochemiczny, immunochemiczny lub genetyczny. Reakcje fazy I metabolizmu ksenobiotyków

6. Biomarkery biochemiczne Rolę biomarkerów pełnić mogą białka (w tym enzymy) i metabolity wewnątrzkomórkowe. Ilość, a co za tym idzie aktywność enzymów metabolizujących ksenobiotyki wzrasta w organizmach wystawionych na działanie danego ksenobiotyku. Wzrost aktywności enzymu jest w tym przypadku miarą efektu biologicznego. EROD – o-detylaza etoksyrezorufinowa; AHH – hydroksylaza węglowodorów arylowych; GSH – glutation; PAH – policykliczne węglowodory aromatyczne

7. Biomarkery immunochemiczne Rolę takich biomarkerów pełnią przeciwciała specyficznie wiążące antygeny pochodzące od ksenobiotyków. Specyficzność ta wykorzystywana jest w testach ELISA. Biomarkery genetyczne Zasadą metody jest wykorzystanie genów kodujących białka emitujące światło lub wywołujące efekt barwny, wbudowanych w taki sposób, aby odpowiedź (świecenie, zmiana barwy) powstawała w odpowiedzi na obecność polutanta. Odpowiedź barwna – przykłady Gen gusA kodujący białko rozszczepiające X-gal, połączony z obszarem promotorowym uaktywnianym przez polutant. Szczep E. coli zawierający plazmid z genem lacZ, połączonym z genem kodującym arsR – białko regulatorowe operonu ars (odpowiedzialnego za usuwanie antymonu i arsenianów). Aktywność -galaktozydazy wytwarzanej w takich komórkach w obecności arsenianów lub antymonu, może być oznaczana z użyciem chromogennego substratu.

8. Testy ELISA Mechanizm odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego

9. Testy ELISA Rodzaje immunoglobulin

10. Testy ELISA Struktura przeciwciała IgG

11. Testy ELISA Antygeny makromolekuły (białka, polisacharydy, kwasy nukleinowe) wywołujące biosyntezę przeciwciał Determinanta antygenowa/Epitop Fragment antygenu rozpoznawany przez przeciwciało Hapteny Małe, obce cząsteczki zawierające epitopy rozpoznawalne przez przeciwciała. Hapten może indukować tworzenie przeciwciała pod warunkiem, że jest połączony z makromolekularnym nośnikiem

12. Testy ELISA Przeciwciało monoklonalne – przeciwciało specyficzne wobec danego antygenu, o zdefiniowanej sekwencji łańcuchów polipeptydowych; wytwarzane przez komórki klonalne (jednego genotypu) w hodowli tkankowej Przeciwciała poliklonalne – zestaw przeciwciał monoklonal- nych, wiążących dany antygen, wytwarzanych przez immunizowany organizm zwierzęcy

13. Testy ELISA Preparatyka przeciwciał monoklonalnych

14. Testy ELISA Zasada dwóch technik ELISA

15. Biomarkery genetyczne Białka luminescencyjne Lucyferaza bakteryjna – gen luxAB Lucyferaza eukariotyczna – gen luc Zielone białko fluoryzujace (GFP) z meduzy Aqorea victoria – gen gfp Przykład zastosowania: Szczep E. coli, w którym gen luxAB z Vibrio harveyi znajduje się pod kontrolą promotora alkB z Pseudomonas oleovorans. Komórki odpowiadają świeceniem na obecność alkanów.

16. Testy toksyczności • Rodzaje testów: • Testy przeżywalności (wyznaczanie wartości LC50, głównie • organizmy wodne) • Testy wzrostowe (bakterie, grzyby, glony, wyznaczanie wartości • EC50) • Testy enzymatyczne – hamowanie aktywności enzymu lub grupy • enzymów u wybranych bioindykatorów • Testy genotoksyczności (mutagenności) • Testy bioakumulacji

17. Testy toksyczności Przykłady organizmów wykorzystywanych w testach toksyczności Bakterie: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Vibrio Grzyby: Candida, Saccharomyces, Penicillium, Aspergillus Glony: Chlorella, Scenedesmus, Selenastrum Pierwotniaki: Spirostomum, Vorticella, Paramaecium Wrotki: Brachionus Skorupiaki: Daphnia, Gammarus, Artemia, Mysis, Asellus, Hyalella Owady: Ephemerella, Hydropsyche, Chironomus Mięczaki: Physa acuta, Planorbarius coernus, Dreissena polymorpha Ryby: Lebistes reticulatus (Gupik pawie oczko), Brachydanio rerio (Danio pręgowany) ), także innych 150 gatunków

18. Testy toksyczności Testy z wykorzystaniem roślin i glonów Kolorem czerwonym zaznaczono organizmy najpowszechniej wykorzystywane w testach. Testy polegają na podaniu hodowli glonów działaniu związku przez 3 – 4 dni i określeniu wartości EC50. W przypadku organizmów poziomu 2 ekspozycja trwa 24 h.

19. Testy toksyczności Testy z wykorzystaniem bakterii luminescencyjnych Miarą toksyczności jest redukcja emisji światła przez bakterie świecące. Porównuje się poziom emisji światła próbek hodowli poddanych działaniu związku badanego z poziomem emisji hodowli kontrolnej.

20. Bakterie świecące Morfologia Vibrio fischeri Kolonie bakterii Photobacterium luciferum Wzrost Vibrio fischeri na podłożu agarowym BOSS, Z lewej – zdjęcie przy oświetleniu normalnym; z prawej – zdjęcie wykonane w ciemności przy czasie ekspozycji 40 s.

21. Na podstawie materiałów z National Centre for Biotechnology Education. Autor rysunków: Paul Stevens

22. Testy toksyczności System BIOTOX do określania toksyczności związków chemicznych BIOTOX  - test wykorzystujący bakterie luminescencyjne Vibrio fischeri. Reakcją testową jest obniżenie luminescencji (świecenia) bakterii. Czas inkubacji jest wyjątkowo krótki – tylko 15 minut. Test wykonuje się wg standardowej procedury producenta, przy użyciu analizatora i liofilizowanych bakterii.

23. Spirotox- test wykorzystujący pierwotniaki Spirostomum ambiguum. W teście tym obserwuje się dwa rodzaje reakcji testowych: deformacje komórki oraz śmierć komórki. Na podstawie wyników obliczane są dwie wartości: EC50 – stężenie wywołujące 50% przyżyciową reakcję testową oraz LC50 – stężenie wywołujące 50% śmietelną reakcję testową. Standardowy czas trwania testu (inkubacji) wynosi 24 godziny, chociaż w wielu przypadkach reakcje testowe występują już po 2 godzinach. Protoxkit F™ - Toxkit wykorzystujący pierwotniaka Tetrahymena termophila. Reakcją testową jest inhibicja wzrostu pierwotniaków. Jej miarą jest spadek gęstości pokarmu (bakterii) mierzony spektrofotometrycznie. Jest to test chroniczny pozwalający w ciągu jedynie 24 godzin ocenić wpływ badanej próbki na kilka pokoleń pierwotniaków. Rotoxkit F™ -Toxkit wykorzystujący wrotka Brachionus calyciflorus. Reakcją testową jest śmierć organizmu. Daphtoxkit F™ magna - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Daphnia magna. Standardowy test toksyczności przeprowadzony wg zaleceń OECD. Reakcją testową jest zahamowanie ruchu skorupiaków (immobilizacja) obserwowana po 24 i 48 godzinach inkubacji. Test wykonuje się przy zastosowaniu dafni świeżo wylęgłych z jaj przetrwalnych (Creasel, Deinze, Belgia). Procedura ta umożliwia eliminację ciągłej hodowli organizmów. Thamnotoxkit F™ - Toxkit wykorzystujący skorupiaka Thamnocephalus platyurus. Reakcją testową jest śmierć skorupiaków. Test wykonuje się przy zastosowaniu organizmów świeżo wylęgłych z jaj przetrwalnych (Creasel, Deinze, Belgia). Test ten polecany jest jako tańsza alternatywa dla testu Daphnia. W wielu przypadkach test ten jest bardziej czuły na obecność substancji toksycznych niż standardowy test Daphnia.

24. Testy toksyczności

25. Testy toksyczności Polskie normy badania toksyczności: glony Chlorella vulgaris, skorupiaki Daphnia magna i Gammarus varoviensis oraz ryby Lebistes reticulatus Normy ISO EN ISO 6341 Test oparty na hamowaniu mobilności Daphnia magna EN ISO 7346 Test pomiaru toksyczności wobec Brachydanio rerio EN ISO 28692 Test hamowania wzrostu Selenastrum capricornutum, Senendesus subspicatus ISO 113480 Test toksyczności z wykorzystaniem bakterii luminescencyjnych Vibrio fischeri ISO 10712 Test hamowania wzrostu Pseudomonas putida ISO 10229 Test przedłużonej toksyczności – wpływ na tempo wzrostu pstrąga tęczowego

26. Testy genotoksyczności Mutageneza • Typy mutacji • Substytucja zamiana zasady na inną • - tranzycja A  G lub C  T • - tranwersja A lub G  T lub C • Delecja usuniecie jednej lub większej liczby zasad • Insercja wstawienie jednej lub większej liczby zasad • Mechanizmy molekularne: • modyfikacja chemiczna • wprowadzenie analogu zasady • interkalacja • modyfikacja fizyczna (UV, promieniowanie gamma)

27. Mutageneza mutagen komórki zabite (1) (4) (5) genotyp genotyp genotyp (3) uszkodzony trwale zmutowany wyj ściowy (6) (2) populacja 1 – mutacje pierwotne 2 – mechanizm naprawczy; odtworzenie stanu pierwotnego 3 – mechanizm naprawczy; mutacje wtórne 4 – śmierć komórki 5 – śmierć komórki 6 – namnażanie zmutowanych komórek mutantów Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy

28. Czynniki mutagenne Barwniki akrydynowe prowadzą do powstania mutacji przesunięcia ramki odczytu w wyniku interkalacji pomiędzy pary zasad DNA Związki alkilujące Efektem działania kwasu azotowego(III) jest możliwość mutacji w wyniku tranzycji A-T  C-G

29. Czynniki mutagenne Mechanizm tworzenia mutagennych pochodnych benzo[a]pirenu

30. Testy genotoksyczności (mutagenności Test Amesa Stosuje się mutanty Salmonella typhimurium niezdolne do biosyntezy aminokwasu L-histydyny. Bakterie wysiewa się na podłożu agarowym minimalnym, nie zawierającym histydyny. Związek aplikowany jest na powierzchnię płytki na krążku bibułowym, często wraz z ekstraktem z wątroby szczura. Jeżeli pod wpływem badanego związku nastąpi rewersja do prototrofii (co objawi się w postaci kolonii bakteryjnych), uznaje się związek za genotoksyczny. a/ Płytka kontrolna; b-d/ płytki z krążkami zawierającymi związek mutagenny. Stężenie związku było najwyższe na płytce b, a najniższe na płytce d. Wszystkie płytki zostały zaszczepione identyczną liczbą komórek Salmonella typhimurium (His-).

31. Testy genotoksyczności (mutagenności) SOS-Chromotest Zasada polega na indukcji przez badane związki układu SOS do naprawy uszkodzonego DNA. Gen regulujący ekspresję genów układu SOS (umuC) jest połączony z genem indykatorowym, np. regulującym ekspresję genu kodującego -galaktozydazę. Wzrost aktywności -galaktozydazy stanowi miarę genotoksyczności. Umu-test Procedura podobna do metodyki testy SOS-Chromotest. Stosuje się mutanty Salmonella typhimurium z plazmidem zawierającym gen umuC. Test Mutatox Stosuje się mutanty Vibrio fischeri niezdolne do bioluminescencji. Pod wpływem związków genotoksycznych następuje aktywacja świecenia.

32. Porównanie odpowiedzi różnych biomarkerów i bioindykatorów na pentachlorofenol

33. Biosensory Wyizolowane biomarkery wbudowane w układy pomiarowe. Układ pomiarowy składa się z biosensora, transduktora przetwarzającego sygnał biologiczny na sygnał elektryczny i integratora/rejestratora

34. Biosensory

35. Biosensory Porównanie konstrukcji elektrody tlenowej i biosensora BZT5. W biosensorze komórki drobnoustroju są immobilizowane pomiędzy przepuszczalną dla gazów (w tym tlenu) membraną teflonową a przepuszczalna dla składników środowiska membrana zewnętrzną. Im większa zawartość metabolizowalnych składników w środowisku, tym większa aktywność metaboliczna komórek, a co za tym idzie, szybsza redukcja poziomu tlenu.