470 likes | 553 Views
Autoantitestek vizsgáló módszerei, HLA tipizálás. Természetes IgM> IgG, IgA Alacsony affinitás Magas szérum koncentrációt is elérhet • Polireaktív • CD5 + B1 sejtek. Patológiás IgG, IgA v. IgM Nagy affinitás Magas szérum cc. (mg/ml) Specifikusabb B2 sejtek. Autoantitestek. 2.
E N D
Természetes IgM> IgG, IgA Alacsony affinitás Magas szérum koncentrációt is elérhet • Polireaktív • CD5 + B1 sejtek Patológiás IgG, IgA v. IgM Nagy affinitás Magas szérum cc. (mg/ml) Specifikusabb B2 sejtek Autoantitestek 2
Természetes autoantitestek RA-ban Natural autoantibodies reactive with glycosaminoglycans in rheumatoid arthritis. György B et al. Arthritis Res Ther. 2008;10(5):R110. 3
Természetes autoantitestek által felismert antigének („immunológiai homunculus”) Hősokk fehérjék hsp65, hsp70, hsp90, ubiquitin Enzimek aldoláz, citokróm- c, SOD, NAPDH Sejt membrán komponensek β2-microglobulin, β2 spectrin, acetilkolin receptor Citoplazma komponensei , citoszkeletális elemek aktin, miozin, tubulin, mioglobin, myelin bázikus protein Sejtmag komponensek DNS, hisztonok Plazma fehérjék albumin, IgG, transzferrin Citokinek IL-1, TNF, IFN Hormonok thyreoglobin, inzulin
Autoantitestek kimutatásának szerepe lehet 1. A betegségek patomechanizmusának jobb megértésében 2. A diagnózisban 3. Prognózisban, rizikócsoportok megjelölésében 4. A betegség aktivitásának megítélésében 5. Terápia eredményességének megítélésében 6. Több kórkép együttes előfordulásának (overlap) megítélésében
Az autoimmun betegségek kivizsgálásának menete Feltételezett autoimmun betegség klinikai tünetek alapján SLE szerű tünetek pl.: „pillangószerű” arcpír Pleuritis Nephritis Izületi fájdalmak Szív panaszok Neurológiai tünetek Estére fokozódó izomgyengeség, kettőslátás, nyelészavar Szemszárazság. szájszárazság Reggel tapasztalt izületi merevség, fájdalom, duzzanat, mozgáskorlátozottság Anti-SSA illetve anti-SSB ellenes antitest + Acetil-kolin receptor ellenes antitest + Emelkedett süllyedés, C-reaktiv protein, ANA, RF pozitivitás, anti-ciklikus citrullinált peptid (CCP) ellenes antitest+ Antinukleáris antitest (ANA) Anti-dsDNS, anti-Smith antitest, kromatin ellenes antitest, anti-C1q antitest + Sjögren szindróma SLE Myasthenia gravis Rheumatoid arthritis
Szisztémás lupus erythematosus Immunkomplex betegségek prototípusa Prevalencia nők körében 1:800-1:1000 Utóbbi években az ismert SLE-s betegek száma nőtt világszerte Horváth-L: Clin Exp Rheumatol 2001, 667
Számos különböző autoantitest Színes klinikai kép Pl: vese, kp. Idegrendszer, bőr, ízület, hematológiai érintettség, Raynaud sz. Szisztémás lupus erythematosus Immunkomplex betegségek prototípusa Autoantitestek: Anti DNS (kettős szálú DNS) Rheumatoid faktor (RF) Vvt elleni Thrombocita elleni Beta 2 glikoprotein I elleni Anti C1q Gyakori a cryoglobulinaemia: azaz olyan általában immunglobulinokból álló komplexek, melyek alacsony hőmérsékleten kicsapódnak a szérumból
Ideális laboratóriumi aktivációs marker a betegség aktivitásának megítélésére Anti-DNS AAT és komplement szint együttes változása: Prognosztikus faktor Terápia hatékonyságának követésére alkalmas Prognózis! kezelés C3, C4, CH50 anti-dsDNS rosszabbodás javulás
Autoantitestek kimutatására használt főbb módszerek SLE-ben • • Screening tesztek: • – Direkt immunfluoreszcencia a betegből vett szövetmintán • – Indirekt immunfluoreszcencia: humán Hep2 sejttenyészeten • pl. antinukleáris antitest (ANA) pozitivitás meghatározására • (az autoantitest specifikus mintázatot ad a sejten belül (nukleáris, nukleoláris, centromer, citoplazmatikus, mitokondriális stb mintázat) • • Antigén specifikus vizsgálatok: • A screening teszt eredménye és a klinikai kép alapján antigén • specifikus ELISA, Western blot, vagy radiális immundiffúzió • módszerével. • Cryoglobulinok kimutatása
Indirekt immunfluoreszcencia szerepe a diagnózisban (Hep2 sejtekben) Homogén magfestődés Pl.Anti- dsDNS vagy anti-hiszton Pl:SLE Perifériás „Rimmed „ magfestődés Pl.anti-hiszton Pl. SLE Foltos magfestődés Anti- RNP(nukleáris riboprotein) pl. SLE, Sjögren, vagy normál is! Nukleoláris magfestődés Pl. anti-Topoizomeráz I Pl. Scleroderma 12
Milyen módszerekkel lehet az egyes autoantitesteket kimutatni?
ELISA elve: minden antigén specifikus AAT mérése külön kit-ben Minták Standard • Menete: • Antigénnel fedett ELISA lemez • 2. Blokkolás • 3. Szérum 100x hígításban • 4. Mosás 5. anti-humán IgG / IgM- HRP 6. Mosás 7. Színreakció mérése
Western-blot Az anti-nukleáris antitest egy összefoglaló név, amennyiben az ANA pozitív specifikálni kell, hogy melyik antitest
Cryoglobulin kimutatása 1. Keringö immunoglobulin, mely 37 fok alatti hömérsékleten precipitálódik, felmelegítve ismét feloldódik 2. Autoimmunbetegségeken kívül malignus haematológiai betegségekben illetve fertözésekben pl. hepatitis C is jelen lehet. Alcsoportjai: I. monoclonalis IgG, II polyclonalis IgG és monoclonalis IgM, III polyclonalis IgM rheumafaktor 3. Meghatározás régen: 37 °C-on serumot szeparáljuk, majd 4 °C 2–7 napig tartjuk, ha precipitátum képzödik, 4 °C-on centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk és fiziológiás só oldattal pótoljuk. Ha 37 °C-on a precipitátum feloldódik, cryoglobulin volt Ma: immunelektroforézis vagy immunfixáció, mellyel a cryoglobulin alosztályát is meg lehet határozni
Rheumatoid faktor (RF) SLE: a betegek 30%-a szeropozitív, sz autoimmun betegségek közül rheumatoid arthritisben fordul elő leggyakrabban, a betegek 80%-ában
Reumatoid faktor kimutatása I. • Latex agglutinációs teszt Latex gyöngy + beteg szérumában RF Agglutináció
Reumatoid faktor kimutatása II. 2. Nephelometria
Az autoantitestek prediktív ereje SLE-ben 1. Bizonyos antinukleáris és anti-Ro (SSA) antitestek akár 10 évvel az első tünetek előtt 2. Anti-natív vagy dsDNA antitestek: átlag 2.5 évvel a tünetek előtt, a betegek 55%-ában 3. Anti-ribonukleoprotein és anti-Smith (röviden anti-Sm): néhány hónappal a tünetek előtt Prognózis! The Lancet 2004;363:1544-46.
Rheumatoid arthritis Felnőtt lakosság körében 1:100 prevalencia Az izület destrukciójával járó autoimmun betegség Szinoviális membrán gyulladása Autoantitestek: ANA, anti-ciklikus citrullinált peptid, rheumatoid faktor (RF) 22
Citrullináció Nincs citrullin tRNS, polipeptidekben arginin alakulhat citrullinná Peptidilarginin deimináz (PAD) enzimek segítségével Citrullinálódhat pl: fibrin, vimentin, enoláz stb. 23
Anti- ciklikus citrullinált peptid (anti-CCP) • Az anti-CCP kimutatása különösen korai RA-ban hasznos: • Diagnosztikus és prognosztikus faktor • A betegség során többnyire szintje nem változik • Nem korrelál a betegség aktivitásával 24
Szervspecifikus autoimmun betegségek Myasthenia gravis: ACh receptor , MuSK, ryanodin receptor, titin AT Pemphigus desmoglein elleni AT Basedow- kór TSH receptor elleni AT
Radio-receptor immunoassay (RRA) Pl. anti-AChR AAT, anti-MuSK AATv. anti-TSH AATkimutatása (pmol vagy annál kevesebb) Gamma-számláló Az immunkomplexek centrifugálva a cső aljára kerülnek, ezt mérjük
MHC I MHC I minden magvas sejt felszínén expresszálódik MHC I fiziológiás funkció: az APC felszínén „mutat be” endogén antigént CD8 T sejteknek (beta 2 mikroglobulinnal együtt) gyulladás során expressziója fokozódik (pl. interferonok hatására)
MHC II MHC II antigén prezentáló sejtek felszínén expresszálódik MHC II fiziológiás funkció: az APC felszínén „mutat be” extracelluláris antigént Pl. interferonok hatására nő az expressziója
Öröklődés • Poligénes • Polimorf • Kodomináns
HLA gének terméke kodominánsan expresszálódik, haplotípusok öröklődnek Anyai 6-os kromoszóma MHC I MHC II β2 mikroglobulin 15-öskromoszóma HLA-DP HLA-DQ HLA-DR HLA-DP HLA-DQ HLA-DR HLA-B HLA-C HLA-A HLA-B HLA-C HLA-A Apai 6-os kromoszóma
HLA rendszer nomenklatúrája Régi nomenklatúra: szerológia alapú –HLA után egy vagy több betű a lókusz megjelölésére pl. HLA-B, HLA-DR. Allél megjelölés még egy szám pl. HLA-B27, HLA-B7. 2 évente megújuló, nevezéktan, mely genetikai vizsgáló módszerekre épülve sokkal precízebb megjelölést tesz lehetővé: az adott HLA lókuszon az adott allél: HLA+ betű+*+4 jegyű szám HLA-B*0801
A HLA tipizálás felhasználása • HLA polimorfizmus variánsok (allotípusok) meghatározása. • • Transzplantáció esetén donor-recipiens hisztokompatibilitási viszonyainak egyeztetése. • • Hisztokompatibilitási antigénekkel szembeni szenzitizáció fokának nyomon követése. • • Autoimmun betegségekre predisponáló haplotípusok kimutatása.
HLA tipizálás 1. – Szerológiai módszerek • Mikrocitotoxicitási teszt (Terasaki) tipizáló savók + lymphocyták • Panel reaktív antitest (HLA szenzitizáció fokának meghatározása) • Keresztreakció (donor sejtjei + recipiens savó)
HLA tipizálás Mikrocitotoxicitási teszt (Terasaki)
HLA tipizálás Kevert limfocita kultúra (MLC) Csak II. osztályú antigének kimutatására Transzplantáció előtt negatívnak kell lennie a donor és recipiens T-sejtjeinek vizsgálata során! HTC: human T cell
HLA tipizálás Molekuláris biológiai módszerek • Restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) • Szekvencia specifikus oligonukleotid szonda (PCR-SSOP) • Szekvencia specifikus primerek alkalmazása PCR vizsgálathoz • Szekvencia alapú tipizálás (SBT)-PCR majd szekvenálás lsd. jövő félév Genetika gyakorlatok
Szövet és szerv transzplantáció • Vese transzplantáció esetén: mind HLAI, mind HLA II antigének fontosak, az utóbbiból HLA-DR antigén elsőrendű szerep • Csontvelő transzplantáció: • fő hisztokompatibilitási antigének egyezése a legfontosabb 1. kérdés: Csontvelő transzplantáció esetén a vércsoportantigének egy része is fontos , de a fő vércsoport különbség ebben az esetben nem akadály. MIÉRT? 2. kérdés: Gyakran az ideális donor a HLA azonos testvér. Miért lehet, hogy a testvér sokszor jó donor lehet? 38
HLA-rendszer és a betegségek kapcsolatának rendszere Erdei Anna: Immunológiai módszerek
Súlyos Graft-versus host betegség kialakulásának valószínűsége különböző számú HLA mismatch-ek esetén vese transzplantációt követően Petersdorf EW. Et al Curr. Opinion Immun (1999) 11: 121 40
Leggyakoribb panaszok, labor leletek Gyulladásos derékfájdalom Többnyire 40 év alatt fokozatosan kezdődő Reggel fokozott Gyakran nyugalomban fokozott Fizikai aktivitás csökkenti Süllyedés, CRP, RF negatív Autoantitest termelés nem jellemző!
Eset 1. -20 éves férfi, korábban betegsége nem volt -ügyeletbe jön, hirtelen kialakult jo. térdfájdalom, ami mozgatásra fokozódik, a térde duzzadt -trauma nem történt -labor: magas süllyedés, serum RF, anti-CCP norm. -folyadékot a térdéből leszívják, NSAID-ot kap -1 év mulva jobb szem iritis miatt jelentkezik. Elpanaszolja, hogy bár már a térde nem fáj, erős derékfájdalma szokott lenni, gerince merev -HLAB27 pozitív Mi lehet a diagnózisa? 44
Eset 2. • 27 éves nő keresi fel a nőgyógyászati szakrendelést: • graviditás 4. hónap, spontán abortusz • ízületei fájnak, szájában fekélyek alakultak ki • mindkét oldalon lábszárközépig ujjbenyomatot tartó ödéma • arcon pillangóalakú bőrpír Labor: anti ds DNS: emelkedett RF:emelkedett anti-cardiolipin AT emelkedett Diagnózis? 45
35 éves nő keresi fel a reumatológiai ambulanciát: fő panasza: kezek, lábak, vállak hónapok óta tartó fájdalma MCP, PIP sor és MTP ízületek érzékenyek, duzzadtak Labor: We:110; CRP:40; anti- CCP:1200; RF:580 Kéz és láb RTG: foltos osteoporosis, erosiok Eset 3 Diagnózis? 46