重组 DNA 技术 Recombinant DNA Technology

1. 第二十四章 重组DNA技术 Recombinant DNA Technology （工具酶 目的基因的获得 载体 基因克隆 外源基因的原核表达 真核表达）

2. 克隆(clone) • 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 • 技术水平：分子克隆(molecular clone) • 即DNA 克隆(DNA cloning) • 细胞克隆 • 器官（或组织）克隆 • 个体克隆（动物或植物）　

3. 重组DNA技术（recombinant DNA technology） 又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因克隆（gene cloning) 技术，是指在体外利用酶学方法将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。 克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering）。因此，重组DNA技术又称为基因工程技术。

4. * 重组DNA技术的发展简史 1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1972年 P.Berg 构建第一个重组DNA分子(猿猴病毒DNA和 λ噬菌体DNA) 1973年 S. Cohen首次将DNA片段与质粒连接，并转化入E.coli 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工， 程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功地克隆了“多莉”羊 Mendel Paul Berg Ian Wilmut and “Dolly”

5. 第 一 节 重组DNA技术中常用的 工具酶 Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology

6. 工具酶在重组DNA技术中具有 特殊的用途 • 限制性核酸内切酶 • DNA连接酶 • 碱性磷酸酶 • 反转录酶 • 末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶） • DNA聚合酶Ⅰ • DNA聚合酶I大片段 • Taq DNA聚合酶 • 多核苷酸激酶

7. 重组DNA技术中常用的工具酶

8. G CCTAG GGATCC CCTAGG GATCC G 一、限制性核酸内切酶用于切割DNA 定义: 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶是重组DNA技术中重要的工具酶。 Bam HⅠ +

9. 分类：根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类：根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类（基因工程技术中常用Ⅱ型） ★Ⅰ型：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，需要Mg2+、ATPs-腺苷酰甲硫氨酸作为催化的辅因子，在DNA降解时伴随有ATP的水解。即它具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。若识别位点上两条DNA链均未甲基化，则行使内切酶功能，并在切割DNA同时或之后转变为ATP酶；若位点上只有1条链被甲基化则发挥修饰功能，使另一条链也甲基化；若位点上两条链均甲基化就与位点解离。其显著特点是识别位点和切割部位不一致，无固定切割位点，一般在识别位点以外的1kb（不少于400bp）到几kb（可多达7kb）处随机切割，不产生特异片段，故在基因重组中没有应用价值。 ★ Ⅲ型：与Ⅰ型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活力；不同的是它能在DNA链上的特异位点切割，其切割位点在识别位点以外，对基因工程的意义也不大。

10. GGATCC CCTAGG • ★Ⅱ型：就是通常指的DNA限制性内切酶，在基因工程技术中常用。特点：分子量小，仅需Mg2+作为催化反应辅助因子，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。Ⅱ类酶识别序列特点为回文结构，一般为4~6bps（有些为8或8个以上碱基序列），且富含GC。 • 限制酶的作用 • 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA，犹似高等动物的免疫系统。

11. 属种株 序 （一）重组DNA技术中通常使用Ⅱ型限制酶 命名 HindⅢ Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体； 第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）； 用罗马数字表示发现的先后次序。

12. 属种株 序 命名 EcoRⅠ E=Escherichia，埃希氏菌属 co=coli，大肠杆菌菌种 R=RY13，菌株名 I=第一个被分离到的内切酶

13. （二）Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性 1. 具有特定的识别和切割位点 II型限制性内切酶的识别位点举例（'示切割位点）

14. 2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）

16. GGATCC CCTAGG GTCGAC CAGCTG G CCTAG GATCC G GTC CAG GAC CTG 3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端 HindⅡ Bam HⅠ + + 平端切口 黏端切口 （blunt end） （sticky end）

18. AGATCT TCTAGA GGATCC CCTAGG GATCC G A TCTAG GATCT A G CCTAG 4. 不同的酶可以产生同样的末端 同尾酶（isocaudarner） 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。 Bg lⅡ Bam HⅠ + +

19. G CCTAG C CCCGG CCC GGG G CCTAG GGATCC CCTAGG CCCGGG GGGCCC CCCGGG GGGCCC GGATCC CCTAGG GGG CCC GATCC G GATCC G CCGGG G 5. 不同的酶可以识别同一个序列 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶。 Bam HⅠ + BstⅠ + XmaⅠ + SmaⅠ +

20. 6. 切割会受其他因素的影响 限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。例如，EcoR I在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性（star activity），以EcoR I*表示。

21. 二、DNA连接酶用于催化DNA片段连接 DNA连接酶（DNA ligase）：催化两个相邻的3′-OH和5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。 连接酶的作用机制

22. BamH I

23. 1. 大肠杆菌染色体编码的 DNA连接酶 需NAD+作为辅因子 2. 大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的T4 DNA连接酶 需ATP作为辅因子 DNA连接酶的来源

24. 三、重组DNA 技术中还需使用其他常用工具酶 （一） 碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团 （二）反转录酶以RNA为模板合成cDNA （三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏性末端 （四）DNA聚合酶I主要用于合成DNA （五）DNA聚合酶I大片段保留了有用的酶活性 （六）Taq DNA聚合酶常用于PCR （七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´羟基末端磷酸化

25. 3′ P OH 5′ 3′ OH P 5′ 3′ 5′ OH OH 3′ OH OH 5′ （一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团 来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于脱去DNA（RNA）5′末端的磷酸基团，使5′ -P成为5′ -OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。

26. （二）反转录酶以RNA为模板合成cDNA RNA RNA 5′ 3′ 5′ 3′ AAAAAA 反转录酶 （reverse transcriptase） Oligo-dT 随机引物 AAAAAA TTTTTT cDNA cDNA 反转录酶催化的cDNA合成

27. （三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏端（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏端 3′OH 5′ 3′ 5′ dGTP GG GGG 末端转移酶 5′ 5′ 3′ 3′

28. （四）DNA聚合酶I主要用于合成DNA 大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中常用的DNA聚合酶。其除具有5′→3′聚合酶活性外，还有3′→5′及5′→3′核酸外切酶活性。因其具有5′→3′核酸外切酶活性而常用于DNA探针的缺口平移法（nick translation）标记。

29. （五）DNA聚合酶I大片段保留了有用的酶活性 DNA聚合酶I大片段（large fragment of DNA polymerase I）为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。其保留了5′→3′聚合酶活性及3′→ 5′外切酶活性，失去了5′ →3′外切酶活性。它具有的3′→5′外切酶活性能保证DNA复制的准确性，即把DNA合成过程中错配的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去（该活性称为校对活性）。 Klenow片段的主要用途有：① 补齐双链DNA的3′末端，使其转变成平端；或通过补齐3′端而使3′末端标记；② 在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；③ 用于DNA序列分析。

30. 将黏端转变成平端 OH 3′ 5′ 3′ 5′ G GA A T T DNA聚合酶 C T T A A C T T A A 3′ 5′ 5′ 3′ EcoRⅠ 对5′-黏端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3′-OH端延伸，可填平末端的凹陷并将其转变成平端。

31. 将黏端转变成平端 PstⅠ 5′ 3′ 5′ 3′ C T G C A C 核酸外切酶 G G 5′ 3′ 5′ 3′ 对3′黏端的片段，应用如T4 DNA聚合酶的3′→5′的核酸外切酶活性可切去未配对的序列，将其转变成平端。

32. （六）Taq DNA聚合酶常用于PCR Taq DNA聚合酶具有良好的聚合活性和热稳定性，常用于PCR。该酶具有5′→3′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，但没有3′→5′外切酶活性，因而无3′→5′校对活性，故在PCR反应中如果发生碱基错配，该酶没有校正功能。针对此不足，目前研发出多种高保真耐高温DNA聚合酶，大大降低了PCR过程中的碱基错配率。 另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用，能在所合成DNA链的3′末端加上一个单独的腺苷酸残基（A）。这样的PCR产物可直接与带有3′-T的线性化载体（T载体）连接（即T-A克隆）。

33. （七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´羟基末端磷酸化（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´羟基末端磷酸化 常用的是T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase），该酶含5′多核苷酸激酶和3′磷酸酶活性，能催化ATP的γ-位磷酸向DNA和RNA的5′-羟基转移。 该酶常用于：① DNA或RNA的5′末端标记；② 使没有5′-末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供连接和克隆之用。

34. 第二节 目的DNA的获取 Preparation of Interested DNA

35. 一、化学合成法可直接合成目的DNA 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 应用：一般用于小分子肽类基因的合成

36. * 化学合成法获取目的DNA 色 苯丙 蛋 赖 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列

37. 二、从基因组DNA文库中获取目的DNA 第一步：构建基因组DNA文库（是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息）。 第二步：筛选含有目的基因的克隆。

38. * 从基因组DNA文库获取目的基因 组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶或机械剪切 基因片段 克隆载体 • 基因组DNA文库 • 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌

39. 三、从cDNA文库中获取目的DNA 第一步：构建cDNA文库（包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存了全部的基因表达信息）。 第二步：筛选含有目的cDNA的克隆。

40. cDNA文库 • 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有cDNA片段的集合

41. 基因组DNA文库和cDNA文库的构建

42. 从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选目的DNA的策略从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选目的DNA的策略 1. 菌落或噬斑原位杂交 2. 针对表达文库，可用抗原-抗体或配体-受体结合的原理（亲和筛选法）筛选

43. *从基因组DNA文库获取目的基因 菌落原位杂交法等方法，可从文库中筛选含有目的基因的噬菌体

44. AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA cDNA synthesis AAAAAA AAAAAA Infect cells 从cDNA文库获取目的基因 cDNA library

45. 四、经PCR获取目的DNA 如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文库构建过程。 PCR是一种高效快速的体外DNA聚合程序

46. PCR 体系 • 模板 • 引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • 含Mg2+的缓冲液

47. PCR的过程 • 变性(Denaturing): 经加热使模板DNA 从 dsDNA 变成ssDNA • 退火(Annealing): 引物与模板DNA杂交 • 延伸(Extension): DNA 合成

48. ing

49. PCR的头三个循环

50. 报告基因 报告基因 报告基因 . 五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNA A. 无转录因子：报告基因不表达 “诱饵”DNA序列 酵母单杂交系统 B. 有转录因子：报告基因表达 转录因子 C. 有转录因子 AD/DNA结合蛋白－融合蛋白：报告基因表达 转录因子的 AD DNA结合蛋白