1 / 35

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Cz ęść 3: Badania strukturalne oligonukleotydów

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Cz ęść 3: Badania strukturalne oligonukleotydów. Budowa kwasów nukleinowych – schemat ogólny. zasada azotowa. zasada azotowa. zasada azotowa. 5 ' cukier 3 '. fosforan. 5 ' cukier 3 '. fosforan. 5 ' cukier 3 '. 5 ' koniec.

sahkyo
Download Presentation

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Cz ęść 3: Badania strukturalne oligonukleotydów

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 3: Badania strukturalne oligonukleotydów

  2. Budowa kwasów nukleinowych – schemat ogólny zasada azotowa zasada azotowa zasada azotowa 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' 5' koniec 3' koniec

  3. zasada zasada 2'-deoksyryboza ryboza Budowa kwasów nukleinowych część cukrowa – struktury

  4. Budowa kwasów nukleinowych część cukrowa – przesunięcia chemiczne 1H [ppm] DNA RNA G A C T G A C U H1'5.8 5.8 5.5 6.0 5.6 6.0 5.6 5.6 H2'2.6 2.6 2.0 2.1 4.6 4.7 4.5 4.3 H2''2.7 2.8 2.3 2.6 - - - - H3'4.9 5.0 4.8 4.9 4.5 4.7 4.5 4.6 H4'4.4 4.4 4.1 4.2 4.4 4.5 4.4 4.3 H5'4.0 4.2 4.1 - 4.3 4.5 4.4 4.3 H5''4.1 4.2 4.3 - 4.1 4.2 4.0 4.0 13C [ppm] DNA RNA C1'86 87-92 C2'40 74-76 C3'80 70-75 C4'88 80-84 C5'65 63-69

  5. Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – struktury A, G – puryny C, T(U) - pirymidyny tymina cytozyna uracyl guanina adenina

  6. Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 1H zasada niewymienialne wymienialne TH(6)6.9-7.9NH (3)13-14 CH3(5)1.0-1.9 UH(5)5.0-6.0NH(3)13-14 H(6)6.9-7.9 CH(5)5.0-6.0NH2(4)6.7-7.0/8.1-8.8 H(6)6.9-7.9 AH(2)7.5-8NH2(6)5-6/7-8  H(8)7.7-8.5 GH(2)7.5-8.0NH(1)12-13.6 H(8)7.5-8.3NH2(2)5-6/8-9

  7. Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 13C i 15N DNA RNA G A C T G A C U N1 160 213 151 142 146 222 151 142 C2 157 155 159 154 157 151 158 154 N3 146 222 196 160 160 213 196 160 C4 162 158 168 170 153 150 169 169 C5 117 120 99 114 117 120 95 100 C6 154 150 143 140 162 157 138 139 N7 233 230 233 230 C8 138 142 135 138 N9 170 170 168 169 NH275 81 98

  8. Budowa kwasów nukleinowych sprzężenia spinowe cukier 1J(C1’H1’) 170-180 1J( C2’H2’) 155-160 1J( C3’H3’) 140-150 1J( C4’H4’) 145-155 1J( C5’H5’) 145-150 1J( C5’H5’’) 145-150 zasada azotowa imina 1J(NH) 90 1J(CH) 180-225 1J(C8N9) 4-8 1J(C8N7) 10 1J(C6N1) 13 cukier – zasada 1J(C1’N1) 11-13 1J(C1’N9) 11-13

  9. Komplet sprzężeń 1J w guaninie K. Ruszczyńska et al., Biophysical Journal,85, 1450 (2003).

  10. Struktura drugorzędowa kwasów nukleinowych http://rmn.iqfr.csic.es/guide/eNMR/adn/watson.html

  11. Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych dwuniciowe helisy A B Z B: typowa dla dwuniciowego DNA w komórkach A: dwuniciowy RNA i DNA+RNA Z: obszary DNA posiadające naprzemiennie puryny i pirymidyny; np. 5'-CGCGATCG-3'

  12. Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych trypleksy tetrapleksy

  13. Motywy drugorzędowe struktury RNA Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych Rodzaje RNA rybosomalny (rRNA) matrycowy (mRNA) transportujący (tRNA) niekodujący (ncRNA) Struktury RNA

  14. Przypomnienie Ogólna strategia wyznaczania struktur białek 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego białka lub kompleksu białkowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

  15. Ogólna strategia wyznaczania struktur kwasów nukleinowych 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego kwasu nukleinowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

  16. RNA - 34 nt; typowe widmo 1H NMR H2',H3',H4',H5',H5'' H2,H6,H8,NH2 H5,H1' NH

  17. DNA - 20 nt; typowe widmo 1H NMR różnice względem RNA: H2',H2'' oddzielone; CH3(T)

  18. Przypisanie sygnałów: RNA - korelacje H1'/H2'

  19. Przypisanie sygnałów: RNA – korelacje H1'/C1' 20-nt RNA, naturalna zawartość 13C, 30 oC

  20. Przypisanie sygnałów: RNA –korelacje H2'/C2'…H5'H5''/C5'

  21. Przypisanie sygnałów: DNA – korelacje H2/H7 w tyminach

  22. Przypisanie sygnałów: korelacje H5/H6 w cytozynach i uracylach

  23. Przypisanie sygnałów: korelacje C5/H5 w cytozynach i uracylach

  24. Przypisania sekwencyjne: korelacje 1H/31P

  25. C33 2.45 Å C26 H5-H6 G1 Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H5/H1' A A A G 15 2D NOESY G C U A 20 G C C G A A 10 U U U 25 G C A U H2 / H6 / H8 (ppm) U G G C 5 C G 30 A U C G G C 5’ 3’ 800 MHz, m=300ms,100% 2H2O, 25°CH1' / H5 (ppm)

  26. Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H6,H8/H1' 20 nt RNA, NOESY

  27. Przypisania sekwencyjne: DNA – korelacje H6,H8/H1' 27 nt DNA, NOESY

  28. Inne możliwe przypisania sekwencyjne: DNA i RNA H6,H8/H2' H6,H8/H2' H6,H8/H2'' 2H6,H8/H3' H6,H8/H4'

  29. Przypisania sekwencyjne: korelacje protonów iminowych (tylko G i T/U) U20G21 G19 A22 G18 – C23 G17 – C24 C16 – G25 A15 – U26 U13 C14 – G27 C12 C11 U10 U9 A8 C7 – G28 A6 – U29 G5 – C30 G4 – C31 A3 – U32 G2 – C33 G1 – C34

  30. Przypisania w oligonukleotydach znakowanych cukry 3D HCCH-COSY 3D HCCH-TOCSY zasady 3D HbCbNb H6-C6-N1 H8-C8-N9

  31. Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada 3D HCN lub 2D H(C)N H1'-C1' -N1/N9

  32. Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada 2D H(C)N

  33. 6 – 7 Hz 1hJNH 2 – 4 Hz Więzy wiązań wodorowych – parowanie zasad 2JNN 2D H(N)N-COSY

  34. Parowanie zasad 2D HNN-COSY 2D NOESY N1 N3 15N (ppm) N3 1H (ppm) N1 800 MhHz, 95% H2O, 5°C1H (ppm) 10 800 MHz, 95% H2O, 5°C1H (ppm)

  35. Powody, dla których dotychczas wyznaczono niewiele struktur oligonukleotydów DNA mało interesujące – podwójna helisa, parowanieW-C RNA – interesujące, ale znacznie trudniejsze: widma trudniejsze w interpretacji – degeneracja przesunięć chemicznych w cukrach, trudne w otrzymywaniu: trzeba dysponować znakowanymi trójfosforanami rybonukleotydów, matrycą DNA i polimerazą RNA; niska wydajność, bardzo trudne w utrzymaniu: rozkład powodują ślady metali, nukleazy, autoliza i znikają

More Related