Pátráme po mikrobech Díl I. Úvod do diagnostiky mikrobů Mikroskopie mikrobů

1. Pátráme po mikrobechDíl I.Úvod do diagnostiky mikrobůMikroskopie mikrobů e-learningová verze Autor prezentace: Ondřej Zahradníček K praktickému cvičení pro VLLM0421c Kontakt na mne: zahradnicek@fnusa.cz

2. Hypertextové odkazy na jednotlivé části Dvě pohádky na úvod Bezpečnost v laboratoři a praktické rady Klinická mikroskopie, definice a návaznosti Morfologie bakterií Diagnostika bakterií Mikroskopie Nativní preparát Barvený preparát Gramovo barvení Další barvicí metody Praktické poznámky k mikroskopii

3. Pohádky na úvod

4. Pohádka 1 • Sešel se jednou vlk, medvěd a virus HIV.Vlk povídá: Chtěl jsem zakousnout člověka, ale on měl pušku, a tou by mě byl zastřelil. Tak tak, že jsem utekl. Ale ty, medvěde jsi větší, třeba by sis poradil. • Medvěd zavrtěl hlavou: Kdepak, člověk má silné pušky, kterými snadno zabije i mě. • Vtom se zachechtalo něco, co ani nebylo vidět. Ale já ho dostanu, uvidíte! Byl to virus HIV…

5. Pohádka 2(má reálný základ, leč značně přibarveno ) • Byl jednou jeden Dán, a ten se jmenoval Christian Gram. Barvil si bakterie a byl naštvaný. Občas nabarvil vzorek od pacienta, jenže kromě bakterií si obarvil i epitelie, a to se mu nelíbilo. „Hnusné epitelie, zakrývají mi bakterie!“, nadával. • A tak začal bádat. Hledal nějaký postup, při kterém by bakterie zůstaly nabarvené, ale epitelie by barevné nebyly… Pokračování na další obrazovce

6. Pokračování pohádky • Přišel na to, že když vzorek obarví krystalovou nebo genciánovou violetí, a pak vazbu barviva na buněčnou stěnu posílí Lugolovým roztokem, neodbarví se bakterie ani alkoholem. Zato epitelie se odbarví. „Hurá“, zakřičel, když to zjistil. • Jenže záhy zjistil, že s epiteliemi se mu odbarví i část bakterií. „K čertu“, zabručel, vypil zbytek alkoholu, co měl na odbarvování, a svou práci mrštil do kouta…

7. A pohádka končí… • O nějakých dvacet let později jistý mladý badatel našel v koutě jedné badatelny zaprášenou práci pana Christiana Grama. • Jak si to tak pročítal, pokyvoval hlavou a říkal si –hm, nebylo to špatné, jen to chtělo něco přidat. • A tak na závěr procesu Gramova barvení přidal dobarvení safraninem (nebo Gabbetemčili karbolfuchsinem). Sice obarvil na červeno nejen odbarvené bakterie, ale i epitelie, ale to mu vůbec nevadilo. Vždyť o přítomnosti epitelií ve vzorku může být užitečné vědět! • A tak vzniklo Gramovo barvení v dnešní podobě.

8. Bezpečnost v laboratoři a praktické rady

9. Praktické rady • Šatní skříňky pro studenty jsou 1., 2. a 4. od okna. Nepoužívejte 3. skříňku, i kdyby byla otevřená. Je to skříňka studentů střední zdravotnické školy. • Klíče od šatních skříněk nechávejte vždy na háčcích vedle dveří • Nad tímto stolkem vždy visí klíček od WC. Když si ho půjčíte, vždy ho tam vraťte. • Vstup studentů do prostor ústavu za praktikárnou je zakázán.

10. Co s odpady a odpadky • Malé kousky můžete dát do nádobek na svých stolech • Použité zápalky mají své vlastní krabičky • Větší odpadky vyhazujte do koše vedle umyvadel • Rozbité sklo patří do plechovky se srdíčky  vedle koše • Mikroskopické preparáty připravené přímo vámi patří po použití do desinfekce • Prosíme, nenechávejte na stolech nepořádek (zbytky z gumování a ořezávání tužek apod.)

11. Literatura • Bezpodmínečně potřebujete Protokoly k.praktickým cvičením (IS MU) • Časem budete potřebovat Lékařskou mikrobiologii obecnou a Lékařskou mikrobiologii speciální • Hodí se i Lékařská mikrobiologie II – vyšetřovací metody, ale není nezbytná (a je hrozně drahá)

12. Učebnice Lékařská mikrobiologie speciální (obecná je tenčí a modrá) Foto: archiv MÚ

13. Podmínky zápočtu • Účast v praktiku by měla být pokud možno stoprocentní • Pokud výjimečně máte omluvenou absenci, nezbavuje vás to povinnosti doplnit si příslušný protokol a kontrolní otázky a případně si i praktikum nahradit (zvláště u > 2 absencí) • Pro zápočet je také nutno mít vyplněny všechny kontrolní otázky na IS MU • Další podmínkou zápočtu je zápočtový test

14. Další pokyny • Obrázky opravdu kreslete (nakreslete koky, nepište „vidím koky“) • Obrázky kreslete barevně, noste pastelky • Kreslete to, co vidíte (pokud se vám koky v mikroskopu dotýkají, kreslete je tak, nekreslete jen obrysy, ale probarvujte) • Pokud nevidíte to, co máte vidět, upozorněte asistenta • Protokoly jsou kontrolovány u zkoušky a mají vliv na výslednou známku!

15. Důkaz, že na protokoly se opravdu hledí

16. Koky se v mikroskopu opravdu dotýkají

17. ISový odpovědník Po prostudování této prezentace si ověřte, zda víte odpovědi na následující otázky, případně hledejte odpovědi na ně jinde. Až budete odpovědi vědět, vyplňte odpovědník. 1. V jakých situacích používáme v mikroskopii nativní preparát? 2. Jaké jsou základní tvary bakteriálních buněk? 3. Jaké je možné uspořádání koků? 4. Jak se nazývá mikroskopie, při níž je objekt osvětlen šikmo? 5. Jaké jsou rozdíly mezi nativním a barveným preparátem? 6. Jak po sobě následují chemikálie v Gramově barvení? 7. Které bakterie se Gramem nebarví anebo barví špatně? 8. Jakou barvu mají různé mikroorganismy v Gramově barvení? 9. Jaké další barvicí metody se používají v lékařské mikrobiologii? 10. Jak se Gramem obarví epitelie či bílé krvinky? Podobně budete vyplňovat odpovědník ke všem dalším praktikům.

18. Klinická mikrobiologie (definice, návaznost na jiné obory)

19. Zařazení našeho oboru Mikrobiologie rostlin Molekulární biologie a genetika Infekční lékařství Humánní klinická mikrobiologie Epidemiologie infekčních nemocí Obecná mikrobiologie Veterinární klinická mikrobiologie Dermato- venerologie Buněčná biologie

20. Co je to mikrob • Musí to být živé. Zrníčko prachu není mikrob, i když je mikroskopické • Musí to být mikroskopické. Žirafa není mikrob, i když je živá Z druhé podmínky se připouštějí výjimky. Třeba tasemnice patří do mikrobiologie přesto, že mohou mít deset metrů. Ale jejich vajíčka jsou mikroskopická.

21. Kdo jsou kliničtí mikrobiologové Základní mikrobiologický výzkum Klinická mikrobiologie Jiné medicínské obory Průmyslová mikrobiologie Chemicko- technologické školy Přírodovědecké a podobné fakulty Lékařské fakulty Vaši učitelé jsou modře

22. Co jsou všechno mikroby • Mikroby jsou tedy například mikroskopické řasy a sinice, archea (dříve archeobaktérie), různé organismy schopné vydržet hluboko pod mořem nebo v extrémních podmínkách horkých pramenů • Jako klinického mikrobiologa mne tyto mikroby neživí, přesto musím uvést, že jsou zajímavé a úžasné

23. Co tyhle mikroby umí • Přežívají v moři v hloubce 10 km • Přežijí i teploty kolem 110 stupňů Celsia • Vydrží značnou radioaktivitu • Jsou schopny místo kyslíku „dýchat“ síru či dusík (zkrátka, mají jiný akceptor elektronů než atom kyslíku) • Mnoho věcí ovšem umějí i mikroby lékařsky významné, jak si povíme dále

24. www.meningitis.de/erreger/meningokokken.html Neisserie

25. Třídění živých organismů • Priony – neobsahují DNA, většinou se vůbec nepovažují za živé organismy • Viry a bakteriofágy • Buněčné organismy • Archea (archeobakterie) • Eubacteria (eubakterie) • Eucarya (eukaryotní organismy) • jednobuněčné • mnohobuněčné

26. Klinicky významné mikroby 1 • Klinicky významné mikroby jsou takové, které jsou významné pro lidské tělo (ne tedy pro člověka = tvůrce, ale pro člověka = objekt) • „Významné pro tělo“ ani zdaleka není totéž jako „tělu škodlivé“. Naopak, mnohé jsou neškodné, nebo dokonce pomáhají

27. Klinicky významné mikroby 2 • Každý organismus má své klinicky významné mikroby: člověk, každý druh zvířete či rostliny. • Dokonce i některé mikroby (třeba bakterie) mají své mikroby (bakteriofágy).

28. Neisseria gonorrhoeae http://medicine.plosjournals.org/archive/1549-1676/2/1/figure/10.1371_journal.pmed.0020024.g001-M.jpg

29. Hlavní klinicky významné mikroby • Viry (a priony) • Bakterie (třeba streptokok nebo Escherichia) • Houby (kvasinky a plísně) • Paraziti – přesahují pojem mikrob: • Vnitřní paraziti • Prvoci (třeba původce malárie) • Motolice (třeba motolice jaterní) • Hlístice (třeba roup nebo škrkavka) • Tasemnice (třeba tasemnice dlouhočlenná) • Vnější paraziti (vši, blechy, štěnice)

30. Kresbu vytvořil as. MUDr. Petr Ondrovčík, CSc., dlouholetý asistent MÚ (zemřel po dlouhé nemoci v říjnu 2007) Bakterie jsou zajímavé!

31. Morfologie bakterií

32. Morfologie vybraných klinicky významných mikroorganismů • Viry se skládají z DNA či RNA a proeinů; některé viry obsahují i obal „ukradený“ hostitelské buňce • Viry mají kubickou nebo šroubovicovou symetrii. Některé z nich jsou schopny tvořit„pseudokrystaly“ • Kvasinky mají tvar vajíčka, mohou pučet a tvořit tzv. pseudomycelia. Na svém povrchu mají buněčnou stěnu. Jsou eukaryotní. • Vláknité houby a parazité mají velmi rozmanité tvary, a také rozličná vývojová stádia. I ony jsou eukaryotní.

33. Morfologie bakterií • Koky ve dvojicích (diplokoky), v řetízcích a ve shlucích (neříkejme raději „streptokoky“ a „stafylokoky“, bylo by to matoucí) • Tyčinky rovné či zahnuté (vibria), případně několikrát zahnuté (spirily), krátké nebo dlouhé, tvořící až vlákna či rozvětvená vlákna; konce mohou být oblé či špičaté a i tyčinky můžou být různě uspořádané • Kokobacily (někdo říká i kokotyčinky) • Spirochety – tenké spirálovité bakterie • Beztvaré bakterie, například mykoplasmata (nemají buněčnou stěnu, jejich tvar je proto proměnlivý)

34. Koky v řetízcích (elektronová mikrofotografie Enterococcus sp.) http://www.morgenwelt.de/typo3temp/5ce14d39b5.jpg

35. Zprohýbaná tyčinka – helikobakter http://vietsciences.free.fr/nobel/medecine/images/helicobacter%2520pylori.JPG

36. www.primer.ru/std/gallery_std/treponema.htm Spirochety http://nl.wikipedia.org/wiki/Afbeelding:TreponemaPallidum.jpg

37. Fimbrie a bičíky • Mnohé bakterie jsou schopny pohybu • Pohybují se pomocí bičíku • Fimbrie (pilli) se užívají k pohybu, adhesi a výměně genetické informace • Bakteriální bičíky jsou odlišné od bičíků eukaryotních organismů • Bičíky ani fimbrie nejsou viditelné v optickém, ale často ani v elektronovém mikroskopu

38. Bakterie s bičíky (Escherichia coli) http://www.biotox.cz/toxikon/bacteria/bacteria/obr/escherichia_coli_1.htm

39. www.cbc.ca Pouzdro a biofilm • Pouzdro obklopuje jednotlivou bakterii, popř. dvojici. Není to už integrální součást bakteriální buňky, spíš nánosy molekul (většinou polysacharidů), které buňku chrání. Barví se většinou negativně (jako světlé místo na obarveném pozadí) • Biofilm je souvislá vrstva, vzniklá z bakterií, jejich pouzder a dalšího materiálu. Biofilm je mnohem odolnější než jednotlivá bakterie, žijící v tzv. planktonické formě

40. Tvorba endospor (sporulace) • Sporulace je něco jako zimní spánek, ale mnohem intenzivnější • Endospory mohou přežít vysoké teploty, vyschnutí, desinfekci apod. • Endospora vznik vchlípením: buňka je rozdělena, ale ne kompletně. Z jedné části se stane endospora, která je včleněna do druhé části • Bakteriální endospory × spory hub!

41. Endospory různých druhů rodu Bacillus http://membres.lycos.fr/neb5000/BacteriologieI/Groupes%20Bacteriens/Batonnets%20et%20coque%20Gram-positifs%20formant%20des%20endospores.htm

42. Endospory se samy o sobě nebarví. Vidíme je jako „prázdná místa“ v bakteriích www.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Bugs/index.shtml.

43. Diagnostika bakterií

44. Diagnostika: průkaz a určování bakterií • Klinická mikrobiologiev praxi spočívá v tom, že lékař (ať už je to obvodní lékař, ambulantní specialista či lékař z kteréhokoli oddělení nemocnice) pošle do laboratoře vzorek • Úkolem klinickomikrobiologické laboratoře je prokázat v takovém vzorku případnou přítomnost mikrobů a pokud tam jsou, tak je také určit. • Určení nemusí být přesné, ale musí poskytnout dostatek informací pro léčbu

45. Co je to vzorek Vzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře: • kusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) • stěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média. Při diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů.

46. Co je to kmen Kmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba Kmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. Kochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie.

47. Přehled metod • Metody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt (produktem může být například nějaký bakteriální jed – toxin) • Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem (močí, krví, výtěrem z krku a podobně) • Identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu • Metody nepřímé: Hledáme (zpravidla) protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu, odezvou na činnost mikroba

48. Přehled metod přímého průkazu *netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů

49. Mikrobiologická laboratoř Foto O. Z.

50. Mikroskopie