Optická mikroskopie

1. Optická mikroskopie Marek Vodrážka

2. Robert Hook, 1670

3. Carl Zeiss, 1930 Podle některých zdrojů první drobnohled sestavil v roce 1590 v Holandsku Zacharias Jansen. V roce 1610 se na základě Jansenovy konstrukce mikroskopií zabýval Galileo Galilei. Jeden z jednoduchých mikroskopů sestavil v roce 1676 holandský obchodník a vědec Anton van Leeuwenhoek, jehož práce patřily k vrcholům mikroskopického pozorování 17. století. Významné bylo dílo Roberta Hooka Micrographia, v němž popsal v roce 1665 konstrukci mikroskopu s odděleným objektivem, okulárem a osvětlovacím zařízením. Jako první zahájila výrobu mikroskopů firma Carl Zeiss v roce 1847.

4. Současný světelný mikroskop Světelná mikroskopie zahrnuje průchod viditelného světla, které prochází, nebo se odráží od pozorovaného objektu skrz optickou čočku, nebo sérii čoček. Obraz může být zachycován přímo okem, zobrazen na fotografický papír, nebo zpracován digitálně. Zobrazovací systém mikroskopu je soustava čoček uspořádaná tak, aby bylo dosaženo požadovaného zvětšení, vysokého kontrastu strukturních částí, vysoké rozlišovací schopnosti a relativně velké hloubky ostrosti. Mikroskop se skládá z objektivu a okuláru. Objektiv zvětšuje přímo pozorovaný předmět, okulár zvětšuje obraz vytvořený objektivem.

5. Objektiv Objektiv je nejdůležitější část klasického SM (určuje kvalitu obrazu). Objektivy se rozdělují na suché a imerzní. Imerzní objektiv využívá imerzní kapalinu pro snížení zkreslení lomem světla mezi vzorkem o objektivem.

6. Důležité charakteristiky objektivů • Zvětšení Z0 (bývá 2x – 100x) tj. ohnisk. vzdálenost (1,5 – > 20 mm) • Numerická apertura • Předepsaná délka tubusu nebo obrazová vzdálenost • Předepsaná tloušťka krycího skla • Korigované optické vady

7. Okulár • Zvětšení bývá 5x – 25x • Konstrukce většinou ze dvou ploskovypuklých čoček (u korekčních okulárů je čoček více – označení PK) 1. Ramsdenův okulár (pozitivní) – ohnisková rovina je před okulárem 2. Huyghensův okulár (negativní) – ohnisková rov. je mezi čočkami

8. Omezení optické mikroskopie Omezení optické (resp. Světelné) mikroskopie leží ve třech oblastech: • Technologie může zobrazovat pouze tmavé objekty, nebo povrchy s velkým lomem světla. • Lom světla omezuje dosažitelné rozlišení na přibližně dvě desetiny mikrometru. • Dochází ke zkreslení obrazu mimo oblast zaostření světelného paprsku. Živé buňky obvykle postrádají dostatečný kontrast, aby mohly být úspěšně studovány s pomocí optické mikroskopie. Vnitřní struktury buněk jsou bezbarvé a průhledné. Nejběžnějším způsobem jak zvýšit kontrast živých buněk je zabarvení jednotlivých struktur různými odstíny barviv, to ovšem vyžaduje (nebo má za následek) usmrcení a fixaci vzorku. Barvivo také může zanést do vzorku nežádoucí nečistoty a vzorek je poté znehodnocen.

9. Zobrazovací metody v optické mikroskopii • Světlé pole - světelný kužel prochází, nebo se odráží od vzorku a vstupuje do objektivu. • Temné pole - osvětlovací soustava je upravena tak, že paprsky osvětlující preparát nevstupují do objektivu. Paprsky se: odrážejí, lámou, rozptylují či ohýbají. Na vytvoření obrazu se podílí boční ohybová maxima. • Fázový kontrast - metoda slouží ke zvýraznění kontrastu malých fázových objektů, u nichž detaily se absorpcí neliší od okolí, ale způsobují změnu fáze. Metoda převádí rozdíly fází na rozdíly intenzit. • Ultrafialová mikroskopie - zkracováním vlnové délky se zvyšuje rozlišovací schopnost • Infračervená mikroskopie

10. Elektronový mikroskop Elektronový mikroskop je obdobou optického mikroskopu, kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optické čočky elektromagnetickými čočkami, což je vlastně vhodně tvarované magnetické pole. Využívá se toho, že vlnové délky urychlených elektronů jsou o mnoho řádů menší než fotonů viditelného světla. Proto má elektronový mikroskop mnohem vyšší rozlišovací schopnost a může tak dosáhnout mnohem vyššího zvětšení (až 1 000 000×).