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MIKROSKOPIE Griechisch mikro = klein skopien = zu beobachten

MIKROSKOPIE Griechisch mikro = klein skopien = zu beobachten. “Das Beobachten von kleinen Objekten“. PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - I. MIKROSKOPISCHE VERFAHREN PRODUZIEREN LEDIGLICH KONTRASTUNTERSCHIEDE IM ENDBILD LM: Selektive Absorption daher Färbung

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MIKROSKOPIE Griechisch mikro = klein skopien = zu beobachten

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Presentation Transcript

  1. MIKROSKOPIE Griechisch mikro = klein skopien = zu beobachten “Das Beobachten von kleinen Objekten“

  2. PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - I MIKROSKOPISCHE VERFAHREN PRODUZIEREN LEDIGLICH KONTRASTUNTERSCHIEDE IM ENDBILD LM: Selektive Absorption daher Färbung EM: Unterschiedliche Bindung Schwermetallatome; grundsätzlich Schwarz-Weiß wegen der Wellenlänge

  3. PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - II • INTERAKTIONEN ZWISCHEN STRAHL UND DEM OBJEKT • Unterschiedliche Absorption (Änderung der Amplitude) • Normale Lichtmikroskopie • Unterschiedliche Geschwindigkeit (Änderung der Wellenlänge) • Phasenkontrastmikroskopie • Unterschiedliche Brechungsindizes (Änderung in • Schwingungsrichtung) • Polarisationsmikroskopie • Unterschiedliche Streuungskapazitäten (Einlagerung von • Schwermetallatomen) •  Transmissionselektronenmikroskopie

  4. MIKROSKOPISCHE METHODEN: EIN ÜBERBLICK

  5. KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie 1. MITTELS AMPLITUDEN-ÄNDERUNG • DURCH UNTERSCHIEDLICHEN ABSORPTIONEN • Natürlich vorkommende Chromophoren • (z.B. Chlorophyll) • Zellfremde Chromophoren • (z.B. Safranin, Resorcinblau)

  6. KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie 2. MITTELS FLUORESZENZ • Durch Anwendung von: • Chromophoren (z.B. Vital-Farbstoffe) • Chromophor-Konjugaten • (z.B. fluoreszierende Antikörper, • Green Fluorescent Protein) • Absorption: „kurzwellig“ • Austrahlung: „langwellig“

  7. FLUORESZENZMIKROSKOPIE

  8. „CONFOCAL LASER SCANNING“ MIKROSKOPIE -1

  9. „CONFOCAL LASER SCANNING“ MIKROSKOPIE - 2

  10. FLUORESZIERENDE PROTEINE Aequorea victoria Lebende Bakterien die 8 verschiedenen Fluorescent-Proteine exprimieren GFP- Molekule

  11. SCHLIESSZELL-PAAR (BLATT EPIDERMIS) Grün: Mikrotubuli Rot: Chloroplasten

  12. KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie 1. MITTELS PHASEN-VERSCHIEBUNG

  13. NORMALES LM PHASEN KONTRAST

  14. PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE

  15. DIFFERENZIELLE INTERFERENZKONTRAST MIKROSKOPIE (DIC)

  16. KONTRAST-ERZEUGUNG IM EM -I Schwermetallatome verursachen einer Streuung von Elektronen. Solche Elektronen werden durch eine Ringblende vom Endbild ausgegrenzt

  17. KONTRASTERZEUGUNG IN DER EMie Durch Streuung auf Grund von Schwermetallatomen. Abgelenkte Elektronen werden abgeschirmt und Tragen nicht zum Endbild bei.

  18. KONTRASTIERUNGSMÖGLICHKEITEN IN DER ELEKTRONENMIKROSKOPIE • - EINFÜHRUNG/AUFTRAGEN VON SCHWERMETALLEN • z.B. Blei, Gold, Osmium, Uran, Platin • ART DER ZUGABE (PRÄPARATIONSVORGANG): • Positivkontrastierung (Ultradünnschnitte) • Negativkontrastierung (Suspensionspräparate) • (Schräg)Bedampfung (Gefrierbruch)

  19. HERSTELLUNG VON ULTRADÜNN- SCHNITTEN FÜR DIE EMie

  20. DER GOLGI-APPARAT IM DÜNNSCHNITT

  21. BEARBEITUNG VON SUSPENSIONS -PRÄPARATEN FÜR DIE EMie a) Bedampfung b) Negativkontrastierung

  22. DER GOLGI-APPARAT NACH NEGATIVE KONTRASTIERUNG

  23. DIE GEFRIER-BRUCH METHODE - Supra-schnelles Einfrieren - Aufbrechen - Abdrück-Herstellung

  24. DER GOLGIAPPARAT NACH GEFRIERBRUCH

  25. BESONDERHEITEN DER ELEKTRONENMIKROSOPIE VORBEDINGUNGEN FORDERUNGEN AN INTERPRETATIONS- DAS PRÄPARAT PROBLEME Vakuum Wasserfrei (Tot!!) Zelldynamik Durchdringlichkeit Probendicke (<100 nm) Zellrekonstruktion Wechselwirkung Schwermetall- Zellstruktur mit dem e-Strahl kontrastierung

  26. PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - III KEINE VERGRÖßERUNG OHNE FOKUSSIERUNG! LM - Sammellins aus Glas EM - Elektromagnetische Polschuhlinse

  27. MAßSTÄBE IN DER MIKROSKOPIE - I AUFLÖSUNGSVERMÖGEN Definition: Der Begriff AV bezeichnet die Unterschiedbarkeit feiner Strukturen, also den kleinst- und noch wahrnehmbaren Abstand zweier Punkte. d = 0,5  d = Auflösungsvermögen; sin a  = Wellenlänge  = halber Öffnungswinkel d (Auge) = 0.1 mm d (LM) = 500 nm ( = 600 nm;  = 70-80º) d (EM) = 0.3 nm ( = 0.004 nm;  = 0°20‘)

  28. MAßSTÄBE IN DER MIKROSKOPIE - II VERGRÖßERUNG Numerisch: Objektiv x (Zwischenlins) x Okular LM: 100 20 = 2000 EM: 50 20 20 20 = 400,000 „Brauchbare Vergrößerung“: Die Vergrößerung ber der die Auflösungsvermögen erreicht ist. Darüber hinaus gibt es keine Verbessurung der Auflösung!

  29. ART DER MIKROSKOPIE „DURCHSTRAHL“: Transmissionsmikroskopie (LM; EM) Normale EMie (bis 120 kVolt) Hochspannungs EMie (1-2 mVolt) „RASTERSTRAHL“: Confocal-Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) Raster-Elektronenmikroskopie (SEM/REM)

  30. TRANSMISSIONSMIKROSKOPIE EM LM

  31. MIKROSKOPIE: Raster-EM

  32. MIKROSKOPIE ALS SOZIALES WISSENSCHAFT

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