Fundamentos de Proteínas Aula 3 – Estratégias de Purificação e Análises de Proteínas

1. BCM13042 Fundamentos de Proteínas Aula 3 – Estratégias de Purificação e Análises de Proteínas

2. Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total H2O 1 70 Proteínas 3.000 15 Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7 Carbohidratos 50 3 Lipídeos 40 2 Outros Íons - 12 3 Mol. Monoméricas - 500 Principais componentes moleculares da bactéria E. coli O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

3. Métodos de Isolamento de Biomoléculas Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis. Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias: Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas: 1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifuação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

4. MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Lisossomos Lisossomos Mitocôndria Mitocôndria SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi Golgi Núcleo Núcleo Precipitação com Sal/Solvente F F F F 1 2 3 4 Precipitação com Sal/Solvente F F F 2 .2 2 .1 2 .3 Cromatografia Troca Iônica . . . . . . F F F 2 .3.2 2 .3.1 2. 3.N Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2 .3.N.X Gel Filtração 1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente numa mistura complexa. Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas. Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequente-mente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura.

5. MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Lisossomos Lisossomos Mitocôndria Mitocôndria SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi Golgi Núcleo Núcleo Precipitação com Sal/Solvente F F F F 1 2 3 4 Precipitação com Sal/Solvente F F F 2 .2 2 .1 2 .3 Cromatografia Troca Iônica . . . . . . F F F 2 .3.2 2 .3.1 2. 3.N Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2 .3.N.X Gel Filtração 1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total Além dos métodos de purificação, análises complementares devem ser feitas ao longo da purificação, para verificar se o processo de separação está sendo eficiente. A medida da atividade biológica da proteína de interesse e do conteúdo de proteínas de cada fração resultante do processo de separação devem ser feitas a cada passo. Assim, apenas a fração que contém a proteína de interesse, marcada com um círculo vermelho no fluxograma, é submetida à próxima etapa de purificação. • Medida da atividade biológica • - particular para cada proteína • - deve ser quantitativa, para estimar quanto da proteína de interesse há em cada fração. • Medidas do conteúdo proteico (diversos) • - absorbância de luz UV de 280 nm • - métodos colorimétricos • (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)

6. Absortividade molar, e Comprimento de onda Métodos para medida do conteúdo de proteína: A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, especialmente triptofano. A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL. Ácidos nucleicos também absorvem luz UV – máxomo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1

7. Métodos para medida do conteúdo de proteína: Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 1. Cu2+ é chelado pela proteína [Cu2+-proteina] 2. Reação redox Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+-proteína] Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250 • Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas. • Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina. Método de Lowry Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul. BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul,

8. com detergente por ultra-som Material na fonte células Homogeneização (para romper tecidos e células) tecidos Homogenado ou Extrato bruto Material de partida por pressão (prensa francesa) liquefação (Potter) Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.

9. detergente micelas Dependendo da concentração Detergentes iônicos Detergentes não iônicos Proteínas integrais da membrana Complexos não micelares Triton X-100 (polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol) Cetab Cetyltrimethylammonium bromide SDS Dodecil sulfato de sódio Octilglicosídeo (octyl-b-D-glucopyranoside) Deoxicolato de sódio Sendo a proteína de interesse uma proteína de membrana, é necessário solubilizá-la. Para esse fim são utilizados detergentes, que dissolvem a membrana plasmática e formando complexos solúveis com as proteínas. Detergentes podem ser iônicos e não iônicos

10. A centrífuga Amostra sedimentando Câmara blindada rotor ângulo fixo centrifugação diferencial refrigeração vácuo homogenado células intactas pedaços de membrana núcleos mitocôndrias lisossomos ribossomos fração citoplasmática A centrifugação frequentemente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. Através de sucessivas etapas de centrifução com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se obter diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos. sangue centrifugado: separação de plasma e células

11. Força centrífuga Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar. Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g) Centrífuga Clínica Ultracentrífuga (necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração) 1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas 200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos R$ 3.000 US$ 70,000 Preço aproximado

12. Solucões de sacarose com densidades diferentss são colocadas no tubo, uma sobre a outra Amostra é colocada no topo do gradiente 5% sacarose 20% sacarose Baixa densidade Média densidade Alta densidade centrifugação Gradiente separação de: Ficoll-Hypaque leucócitos Sacarose mitocôndrias Cloreto de césio ácidos nucléicos A centrifugação em um meio com gradiente de densidade melhora a eficiência da separação. As partículas se deslocarão através do gradiente até encontrarem uma região com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando “bandas”. Gradientes podem ser utilizados para separar diferentes tipos de células, organelas, ácidos nucléicos, complexos proteicos, etc. Centrifugação em gradiente de densidade

13. NaCl KCl O gráfico ao lado ilustra o efeito de diferentes sais sobre a solubilidade da hemoglobina. Em baixa concentração salina, a solubilidade das proteínas aumenta, pois os íons do sal ajudam a reforçar a camada de solvatação. Em alta concentração salina, a solubilidade das proteínas diminue pois os íons do sal competem pelas moléculas de água disponíveis para formar a sua própria camada de solvatação. Sais com ânions divalentes são mais eficientes do que os monovalentes na precipitação de proteínas. MgSO4 Solubilidade da hemoglobina (S/S’) (NH4)2SO4 Salting-in X Salting-out K2SO4 Concentração do Sal,, Molar As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas. Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas. A precipitação de proteínas pode ser induzida por: - adição de sais (Precipitação salina) - adição de solventes - variação de pH (Precipitação isoelétrica)

14. Hemoglobina Albumina Mioglobina Proteínas apresentam diferente sensibilidade para a precipitação salina. Solubilidade, log - precipitam primeiro: proteínas maiores proteínas mais hidrofóbicas possuem camadas de solvatação maiores ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar. Pseudoglobulina Fibrinogênio Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar Sais se dissociam em solucão aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação. Considere uma solução com fibrinogênio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observe o gráfico. Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4, pode-se purificar completamente o fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois este precipita totalmente em uma saturação de 2,8 M do sal. Neste ponto, centrifuga-se a solução e o fibrinogênio é coletado como um precipitado. Numa próxima etapa, adicionando-se mais sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina. E teremos também purificada a mioglobina, ainda em solúvel na presença de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante.

15. Constante Dielétrica Momento Dipolar Solvente Proteína P.I. Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam a camada de solvatação menos organizada. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 Água Dimetilformamida Metanol Etanol Acetona Clorofórmio Benzeno 78.5 1.85 48.9 3.96 32.6 1.66 24.3 1.68 20.7 2.72 4.8 1.15 2.3 0.00 Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. Os mais utilizados são etanol e acetona. Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

16. Aos precipitados obtidos com sal ou solvente, adiciona-se água. Ao precipitado obtido com variação de pH, retornar ao pH original. Membrana de celofane solvente solução a ser dialisada Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação. final início Dt • Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise. • amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros • tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d. • - o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja • - excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente • - após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.

17. MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Lisossomos Lisossomos Mitocôndria Mitocôndria SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi Golgi Núcleo Núcleo Precipitação com Sal/Solvente F F F F 1 2 3 4 Precipitação com Sal/Solvente F F F 2 .2 2 .1 2 .3 Cromatografia Troca Iônica . . . . . . F F F 2 .3.2 2 .3.1 2. 3.N Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2 .3.N.X Gel Filtração 1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total Até o momento, exploramos as etapas iniciais de purificação de proteínas, como a centrifugação diferencial e precipitação fracionada. Esses métodos, apesar de terem baixo poder de resolução (exploram diferenças grosseiras entre as proteínas), permitem processar grandes volumes ou massas, típicos das etapas iniciais de isolamento. Quando já houve redução significa-tiva dos montantes de proteínas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que irão explorar as diferenças mais sutis entre as moléculas. Não esquecer que todas as frações obtidas devem ter o conteúdo de proteínas e de atividade biológica medidos, para se decidir qual/quais deverão passar para o passo seguinte da purificação.

18. Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: • separação de moléculas pela massa molecular • géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros • Cromatografia de troca iônica: • separação de moléculas pela carga elétrica • géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente • Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica): • separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso • géis possuem carácter hidrofóbico • Cromatografia de afinidade: • separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

19. Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ? • Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína: • Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida • através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes • em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação. • Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína • de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades • específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura). • Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de • partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces- sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas • que apresentam pouca atividade). • Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes • etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse.

20. Purificação da Glicoquinase hepática de Rato Etapa Rendimento Etapa Atividade Específica Atividade Específica b c b Índice Índice b b ( U.mg-1) ( % ) ( % ) ( U . a . - Purificação Purificação Marcha A: somente cromatografias convencionais 1. Sobrenadante de pâncreas 0.17 100 1 2. (NH4) SO4, precipitado 25 -55% 85 12 2.0 2 3. troca iônica, coluna DEAE -Sephadex , pH 7.0, eluição KCl 23 45 140 4. troca iônica, coluna CM - cellulose , pH 5.5, eluição NaCl 44 33 260 6. interação hidrofóbica, coluna Butyl~Sepharose 80 15 480 7. gel - filtração, coluna Sephacryl S -300 130 15 780 Marcha B: com cromatografia de afinidade 1. Sobrenadante de pâncreas 0.09 100 1 2. troca iônica, coluna DEAE - Sephadex , pH 7.0, eluição KCl 18 84 195 a U nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza 3. Afinidade cromatográfica ( benzamidina~agarose ) 420 83 4.500 a transformação de1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas Atividade específica : medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína b c Rendimento : percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação d Índice de Purificação :razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.

21. Tempo zero Tempo 2 Tempo n Tempo 1 Amostra com diferentes componentes Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina Resina embebida em tampão Coletor de frações Concentração Tempo ou volume Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia: • Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como: • massa molecular • carga elétrica • solubilidade • afinidade Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.

22. proteína grande proteína pequena Tampão “empurra” moléculas através da resina grão da resina poroso tubos Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular Moléculas com massas diferentes Fluxo do tampão grãos (beads) da resina com poros Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).

23. traçado da medida de atividade biológica nas frações 25 50 75 100 125 mL volume de eluição A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo. Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular. Curva de calibração Observar a escala log Moléculas maiores Moléculas menores Massa molecular (kD) Absorbância a 280 nm Medida da ativ. biológica Ler a massa correspondente 20 40 60 80 100 120 mL Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao. volume Kav

24. indica quais os tamanhos das partículas que podem entrar nos poros da resina e serem fracionados. Acima ou abaixo da faixa, não há separação. Resinas para Gel-Filtração TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO NOME (kD) Sephadex G - 10 Dextrana 0.05 - 0.70 Sephadex G - 25 Dextrana 1 - 5 Sephadex G - 50 Dextrana 1 - 30 Sephadex G - 100 Dextrana 4 - 150 Sephadex G - 200 Dextrana 5 - 600 Bio - Gel P - 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 Bio - Gel P - 6 Policrilamida 1 - 6 Bio - Gel P - 10 Policrilamida 1.5 - 20 Bio - Gel P - 30 Policrilamida 2.4 - 40 Bio - Gel P - 100 Policrilamida 5 - 100 Bio - Gel P - 300 Policrilamida 60 - 400 Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000 Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000 *Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio - Rad Laboratories Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas Moléculas pequenas Proteínas Moléculas pequenas Proteínas Células, partículas sub-celulares

25. Kav = Ve-Vo Vt-Vo Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de gel-filtração. O gel nessa coluna é o Sephadex G-200, cuja faixa de resolução de proteínas é de 5.000 a 600.000 d. Observe como proteínas nos extremos da faixa de resolução tendem a “sair” da parte linear da curva. Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. Ve – volume de eluição de uma certa proteína Vt – volume total da coluna Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com massa acima da resolução da resina onde:

26. CM DEAE Trocadora de ânions Trocadora de cátions Cromatografia de troca iônica A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH. Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

27. Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 PI ácido básico + - neutro - - - - - - - Cromatografia de troca iônica Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas DEAE-celulose - pH < 10 CM-celulose - pH > 4

28. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica Adsorção No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): • A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: • adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; • eluição das proteínas adsorvidas. Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna Eluição Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna. Na+Cl- + Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.

29. + Eluição NaCl Eluição NaCl _ + + 0. 10 M (+) 0. 10 M (-) + + + = 0. 15 M 0. 15 M DEAE (+) CM (-) _ (-) 0. 20 M _ 0. 20 M = (+) = (-) = (+) _ Não retidas Não retidas + + + + + Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição. As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina). Carboximetil~celulose (trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose (trocadora de ânions)

30. NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH N+(CH ) Troca aniônica 2 3 3 resina de polistireno Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO -H Troca Catiônica 3 resina de polistireno DEAE - celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas - CH CH N+(C H ) ácidas e neutras 2 2 2 5 2 CM - celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas - CH COOH básicas e neutras 2 Combinação de gel filtração Q-Sepharose Gel de dextrano e troca iônica de proteínas básico ácidas e neutras SP -Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração ácido e troca iônica de proteínas básicas e neutras * Dowex: Dow Chemical Co.; Sepharose e Source: GE LifeSciences Bio - Gel: Bio Rad Laboratories Tipos de Resina de troca iônica Tipos de Resina de troca Iônica −Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 —CH2-SO3- Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

31. Adsorção Mistura de proteínas Eluição Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-A Lavagem pH 2,0 ou sal Complexo Ag-AC é desfeito Anti-A interage apenas com a proteína A Coluna empacotada com ess gel Desprezar proteínas não retidas Antígeno A puro - Cromatografia de afinidade: Ex: cromatografia de imunoafinidade Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre

32. Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade 1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo - análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores - haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com “tag” ou “marcação” - glutationa-S-transferase - poli-Histidina 2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: 8-AEA-cAMP 8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate (ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP) Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade

33. Braço espaçador covalente entre a resina e o ligante Molécula-alvo (analito) ligante Ligação reversível não covalente Estratégias para acoplamento deligantes à resina ReagenteAlvo no ligante Preparo da resina de afinidade: Passo 1. Ativação da resina Passo 2. Acoplar o ligante Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina. A introdução de um braço espaçador diminue esse risco.

34. Fase móvel (líquido ou gás) Fase estacionária (suporte sólido) X R = f CROMATOGRAFIA EM PAPEL CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA Suporte: PAPEL Suporte: SÍLICA (camada delgada ou TLC) Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose) Fase Estacionária: sílica (mineral apolar) Fase Móvel: Solvente orgânico(hidrofóbico) Fase Móvel: Solvente aquoso ou água Cromatografia de Partição tempo 0 t 1 t2 tn Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar. Papel ou placa de sílica direção do fluxo do solvente Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc. Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico. Amostra na origem Compostos separados Consiste de 2 sistemas: Cuba com solvente (fluxo por capilaridade) distância de migração da substância distância de migração do solvente

35. Detector Controle e análise dos dados Coletor de frações Coluna e forno bombas Injetor de amostra HPLC: high performance (pressure) liquidchromatography • Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias. • Característica diferencial da cromatografia convencional: • partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) • aumento da eficiência da separação em função do número maior de partículas de resina em um mesmo volume da coluna • fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna Desenho básico de um HPLC Duas bombas permitem eluição em gradiente Detector: índice de refração, absorbância UV ou Vis, fluorescência, etc. Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluição diferencial na fase reversa

36. CN Fenil NH2 C4 C8 C18 Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia Moléculas não retidas Moléculas retidas 100 Fase estacionária Função C18 –Si (CH3)2C18 H37 C8 –Si (CH3)2C8 H17 tC2 –Si C2 H5 Aminopropyl –Si (CH2)3 NH2 Cyanopropyl –Si (CH3)2 (CH2)3CN Diol –Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH Absorbância a 214 nm % de acetonitrila Tempo ou volume de retenção Fase reversa:resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas) Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água - acetonitrila, metanol, propanol

37. aminoácido A proteína pura é tratada com HCl 6N fervente para quebrar (hidrólise) as ligações peptídicas. fluorescência A mistura resultante é submetida a métodos cromatográficos (fase reversa, troca iônica) para separar os diferentes aminoácidos. Tempo de retenção (min) A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido. A área do pico quantifica o aminoácido. Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número e tipos) de seus aminoácidos.

38. Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos atualmente mais utilizados: • Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal. • Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína. • Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e proteômica.

39. (1) ciclo 1 acoplamento (2) hidrólise com ácido trifluoroacético ciclo 2 acoplamento (3) hidrólise ácida vai para novo ciclo análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa) Método de Edman - sequenciamento de proteínas com PITC(fenil-isotiocianato) • Cada ciclo de reação compreende 3 etapas: • Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K); • Hidrólise ácida da proteína conjugada com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S); • Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o novo N-terminal da proteína. Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de proteína.

40. 30 aa sequência obtida a partir da proteína intacta proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros. Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman. Proteína Total 150 a.a Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição de suas sequências.

41. Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas Para sequenciar proteínas é preciso obter o espectro MS/MS de seus peptídeos. Isso significa 2 etapas de MS acopladas. Depois de fazer o MS da molécula inteira, esta é fragmentada dentro do aparelho por colisão com gases. Os fragmentos são então separados e analisados por MS. hélio ou argônio A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido.

42. Espectro MS/MS do peptídeo tríptico GLSDGEWQQVLNVWGK. Analiza-se o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer a seqüência do peptídeos

43. Síntese de peptídeos Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004 H2N bloq COOH bloq • DNA recombinante • Química: uso de reagente químico para ativar o ácido carboxílico de um Nα-acil-aminoácido, o qual sofre o ataque nucleofílico do grupo α- amino de outro aminoácido • - indicado para sequências de até 20 aa. • - estereo-isômeros,purificação dos produtos • Biocatálise: reversão da proteólise • - diminuição da atividade da água no meio reacional reverte a ação de enzimas proteolíticas • - termolisina, pepsina, subtilisina, tripsina, etc • - vantagens:, não forma misturas racêmicas e • sub-produtos, condições brandas

44. Síntese de peptídeos Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila, estável ao ácido trifluoroacético (TFA) e lábil a bases orgânicas – todas as outras carboxilas são protegidas por reagentes lábeis ao TFA e estáveis a bases orgânicas Boc (t-butiloxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila lábil ao (TFA) – todas as outras carboxilas são protegidas por reagentes estáveis a este ácido e lábeis a ácidos inorgânicos fortes ou hidrogenólise.

45. Síntese de peptídeos Robert B. Merrifield – Prêmio Nobel em Química em 1984

46. Síntese de peptídeos

47. - poliacrilamida : proteínas ac. nucleicos não desnaturante ou nativa desnaturante e redutor peso molecular composição de subunidades focalização isoelétrica: PI bidimensional ELETROFORESE ELETROFORESE CONDIÇÕES QUE DETERMINAM A SEPARAÇÃO + + 1. pH / tampão + + 2. Suporte - papel : corrente alta (calor) uso para peptídeos e aminoácidos D T D T + + + + - agarose : ácidos nucléicos Imunoeletroforese Proteínas nativas SUPORTE X pH MEIO

48. + _ • Reação de eletrólise da água • Uso de tampão concentrado • Uso de indicador de pH como marcador de corrida: • azul de bromofenol

49. + persulfate polyacrylamide Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE) • 7 a 15% [acrilamida] – maioria das proteínas • [ ] mais baixas – gel muito mole – • suporte com agarose • Gradiente de acrilamida – aumenta poder de resolução cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

50. Ponto Isoelétrico Proteína Proteína Pepsina < 1.0 Ovalbumina (galinha) 4.6 Albumina Sérica (humana) 4.9 Tropomiosina 5.1 Insulina (bovina) 5.4 Fibrinogênio (humano) 5.8 g - Globulina 6.6 Colágeno 6.6 Mioglobina (cavalo) 7.0 Hemoglobina (humana) 7.1 Ribonuclease A (bovina) 7.8 Citocromo c (cavalo) 10.6 Histona (bovina) 10.8 Lisozima (galinha) 11.0 Salmina ( salmon ) 12.1 Separação na eletroforese nativa é influenciada pela carga, massa e forma da molécula 155.000 330.000 18.000 64.000