Sommario

1. Sommario • La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness • Misurazione della barriera genetica • In vitro, in silico, in vivo • Il ranking delle barriere dei singoli farmaci • Fattori che alterano la barriera genetica • Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi • La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

2. Sommario • La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness • Misurazione della barriera genetica • In vitro, in silico, in vivo • Il ranking delle barriere dei singoli farmaci • Fattori che alterano la barriera genetica • Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi • La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

3. Selezione dei mutanti resistenti ESITO DELLA PRESSIONE SELETTIVA VARIBILITA' NATURALE

4. Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza • Numero di mutazioni necessarie • Tipo di mutazioni • Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente)

5. Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza • Numero di mutazioni necessarie • Tipo di mutazioni • Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente)

6. Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Virus resistente, terapia non più efficace    Bassa barriera genetica Barriera genetica intermedia Elevata barriera genetica    Virus sensibile, terapia efficace

7. Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza • Numero di mutazioni necessarie • Tipo di mutazioni • Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente)

8. Il bias di selezione fra transizioni e trasversioni A C G T,U Purine Pirimidine Le transizioni sono evolutivamente favorite rispetto alle trasversioni trasversione transizione

9. Il bias di ipermutazione G → A • Il sistema cellulare APOBEC3 induce mutazioni G → A in HIV come meccanismo di difesa (geneticmeltdown) • HIV ostacola questo meccanismo bloccando APOBEC3 mediante la propria proteina “accessoria” Vif • Le transizioni G → A sono quindi favorite

10. Ipermutazione G → A

11. Ipermutazione G → AE138K: GAG → AAG M184I: ATG → ATA

12. Mutazioni di resistenza a Rilpivirina nei trial ECHO & THRIVE Kulkarni, IHDRW 2011

13. M184I diminuisce la suscettibilità a Rilpivirina più di M184V Kulkarni, JAIDS 2012

14. Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza • Numero di mutazioni necessarie • Tipo di mutazioni • Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione del virus (fitness) Devono essere selezionate una o più mutazioni perché il virus non sia bloccato dal farmaco (fenotipo resistente)

15. Fitness dei mutanti virali • La fitness di una variante è definita dalla sua capacità di contribuire alla successiva generazione • La fitness è sempre funzione delle condizioni in cui la variante virale si moltiplica (es. variabili correlate ai farmaci e alla risposta immunitaria) • Le diverse varianti competono fra di loro con esiti dipendenti dalle condizioni esterne

16. Misurazione della fitness in vitro • La fitness di un mutante può essere misurata in vari tipi di sistemi virus-cellula in vitro • Non c’è un gold standard di metodo riconosciuto http://bis.urmc.rochester.edu:8080/HIVViralFitness/

17. Pressione farmacologica Sospensione / cambio terapia La cinetica di decadimento dei mutanti off-therapy come indice della fitness in vivo Virus wild type

18. T20-resistance (HR1) Most major PI mutations 65R 74V 184V TAMs R5 → X4 Tropism switch IN mutations Most minor PI mutations NNRTI mutations RT 215 “revertants” La cinetica di decadimento dei mutanti off-therapy come indice della fitness in vivo Fast disappearance Prolonged persistence

19. Sommario • La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness • Misurazione della barriera genetica • In vitro, in silico, in vivo • Il ranking delle barriere dei singoli farmaci • Fattori che alterano la barriera genetica • Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi • La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

20. Misurazione dell'attività antivirale in vitro(IC = InhibitoryConcentration) • IC50, dose di farmaco che inibisce del 50% la produzione di virus • Valore meno corrispondente alla reale inibizione ma misurazione più accurata (usato spesso) • IC90, dose di farmaco che inibisce del 90% la produzione di virus • Valore più corrispondente alla reale inibizione ma misurazione poco accurata (usato raramente) La terapia ha selezionato una variante virale farmacoresistente

21. 450 TMC114 (R41T, K70E) RTV (G16E, M46I, V82F, I84V) 400 SQV (G48V, A71V, G73S, I84V, L90M) NFV (L10F, D30N, R41K, K45I, M46I, V77I, I84V, N88D) 350 300 APV (L10F, V32I, L33F, M46I, I47V, I50V) LPV (L10F, L23I, M46I, I50V, I54V, L63P, V82A) Increase in PI selection concentration 250 TPV (L33V, M46L, V82T) ATV (L10F, V32I, M46I, I62V, A71V, I84V, N88S) 200 150 100 50 0 0 100 300 500 700 900 1100 Time (days) TMC114: an increased genetic barrier to the development of resistance in vitro De Meyer S, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49: 2314-21. De Meyer S, et al. XV IHDRW, 2006,Poster 19.

22. Selezione di resistenza in vitro a NVP, EFV, ETV a partire da wild type 100 Control NVP (1µM) EFV (1µM) 80 TMC125 (1µM) TMC125 (0.2µM) 60 Virus breakthrough (%) 40 20 0 0 4 8 11 15 18 21 24 27 31 Days post-infection TMC125 suppresses the in vitro selection of resistant HIV-1 from wild-type, suggesting an increased genetic barrier to the development of HIV drug resistance Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773-82

23. Selezione di resistenza in vitro a RPV Starting from wild type HIV (IIIB) Azijn, AAC 2010

24. La barriera genetica verso la resistenza in vitro è più elevata per dolutegravir ripetto a raltegravir Seki, CROI 2010

25. Barriera genetica dei singoli antiretrovirali

26. Slow dissociation of DRV as a major contribution to tight binding to HIV protease • Binding affinity of DRV to HIV-1 protease >100-fold higher compared with PIs due to much slower dissociation • Decrease in binding affinity of all PIs on MDR protease mainly caused by increased dissociation rate • In contrast to other PIs, decreases in DRV binding affinity of up to 1000-fold do not compromise antiviral activity • Multiple simultaneous mutations required to make the virus resistant to DRV (i. e. increased genetic barrier) Dierynck, JV 2007

28. EuResist – Evolutionary engine Model HIV evolution under therapy from longitudinal and cross-sectional sequence data For any defined genotype, neighbor mutants can be computed in silicoand the contribution of the expected mutants to resistance can be calculated Functions weight for probability and expected time for mutants to occur Il sistema predittivo bioinformatico della risposta al trattamento EuResist (www.euresist.org) si basa su tre diverse engine, una delle quali calcola la barriera genetica della variante virale Probability to remain susceptible to a drug (below a defined phenotypic threshold) GENETIC BARRIER Altmann et al, AVT 2007

29. Sommario • La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness • Misurazione della barriera genetica • In vitro, in silico, in vivo • Il ranking delle barriere dei singoli farmaci • Fattori che alterano la barriera genetica • Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi • La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

30. The Calculated Genetic Barrier for Antiretroviral DrugResistance Substitutions Is Largely Similar for DifferentHIV-1 Subtypes (van de Vijver et al., JAIDS 2006) *With respect to subtype B. Example: subB 86% Q151M: CAG  ATG (2 transversions) 12% Q151M: CAA  ATG (1 transition, 2 transversions) subF 13% Q151M: CAG  ATG (2 transversions) 83% Q151M: CAA  ATG (1 transition, 2 transversions) Based on analysis of 68 A, 1299 B, 209 C, 24 D, 26 F, 86 G, 20 J, 51 AE, 71 AG sequences from drug-naïve individuals

31. Mutations contributing to resistance to high genetic barrier PIs in different subtypes The prevalence of TPV-RAMs* in HIV-1 subtype A/E and subtype B. *K20M, E35G, K43T, I47V, I54A/M/V, Q58E, T74P, V82L/T, N83D and I84V were not found (Sungkanuparph, JCV 2007).

32. Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C o da K103N Y181C Wild type K103N Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773–82

33. Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C + K103N 100 80 60 40 20 0 Virus breakthrough (%) 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Days post-infection Control TMC125 (0.2µM) TMC125 40nM TMC125 (1µM) Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773-82

34. Selezione di resistenza in vitro a RPV Reference data on wild type virus Azijn, AAC 2010

35. I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica Nthfailure 3rd failure 2nd failure 1st failure

36. I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica • Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera • Resistenza acquisita • Resistenza trasmessa Risposta virologica a 24 settimane di regime terapeutico contenente Darunavir nei trial DUET e POWER (pazienti pretrattati con altri PI)

37. I fallimentiditerapiaabbassano la barrieragenetica • Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera • Resistenza acquisita • Resistenza trasmessa

38. Escape dalla pressione immunologica Kent, Trends Microbiol 2005

39. Impatto delle mutazioni di resistenza sul riconoscimento immunologico KMIGGIGGF (KF9) è un epitopo CTL HLA-B*1501-ristretto che comprende diverse mutazioni di resistenza ai PI (M46I/L, I47A/V, G48V, I50V) • Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza • A seconda dell’aplotipo HLA del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica • Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo • Ancora un’area di indagine Mueller, JAIDS 2011

40. Impatto delle mutazioni di resistenza sul riconoscimento immunologico • Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza • A seconda dell’aplotipo HLA del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica • Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo • Ancora un’area di indagine Gatanaga, AIDS 2010

41. Sommario • La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza • Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni sulla fitness • Misurazione della barriera genetica • In vitro, in silico, in vivo • Il ranking delle barriere dei singoli farmaci • Fattori che alterano la barriera genetica • Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con epitopi • La barriera del singolo farmaco e la barriera della combinazione

42. La terapia combinata rallenta la selezione della resistenza

43. Monotherapy vs. combination therapy and risk of resistance AZT AZT 3TC IDV Resistance to whole regimen develops slowly Resistance to AZT develops quickly

44. Combination therapy and risk of resistance Combination therapy (e.g. AZT+3TC+IDV) AZT AZT AZT 3TC 3TC 3TC IDV IDV IDV Initialresistance (3TC) Third step (AZT+3TC+IDV) Second step (AZT+3TC)

45. Combination therapy and risk of resistance “Combination” therapy (e.g. AZT+3TC+IDV) AZT AZT AZT 3TC 3TC 3TC IDV IDV IDV Initial resistance (3TC) Third step (AZT+3TC+IDV) Second step (AZT+3TC) Local ‘dissociation’ of combination therapy: stepwise accumulation of resistance