Misurazione e uso di anticorpi Misurazione delle funzioni dei linfociti T

1. Misurazione e uso di anticorpiMisurazione delle funzioni dei linfociti T

2. Misurazione e uso di Abs • Saggio ELISA • ELISPOT • Cromatografia d’affinità • Western Blotting • Microscopia ad immunofluorescenza • Citometria a flusso

3. Citometria a flusso

4. Basi della Citometria a Flusso • Cellule in sospensione • passano in singola fila attraverso • un volume illuminato dove esse • riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza • che viene raccolta, filtrata e • convertita ad un valore digitale • che viene inviato al computer Fluidica Ottica Elettronica

5. 350 457 488 514 610 632 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluorocromi utilizzati più comunemente Linee Laser Comuni Coniugato PE-TR Texas Red Ioduro di Propidio Etidio Bromuro PE (ficoeritrina) FITC (fluoresceina) Acido cis- Parinarico

6. Schema generale della camera di flussodi un citofluorimetro Fluido di rivestimento Iniettore Cella di Flusso Granulocito Segnale di Fluorescenza Linfocito Raggio laser focalizzato Monocito

7. Rilevamento dei parametri fisici Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi Sorgente luminosa Luce trasmessa Forward Scatter Luce Riflessa Side Scatter

8. Scatter frontale (Forward Angle Light Scatter, FALS) Granulocito Laser Sensore per il FALS Linfocito Monocito

9. Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” nelladirezione frontale(ovvero lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale delforward scatter • L’ intensità del forward scatter è proporzionale alladimensione,formaedomogeneitàottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

10. Laser Sensore FALS Sensore per il 90°LS Scatter laterale (90 Degree Light Scatter) Granulocito Linfocito Monocito

11. Quando si utilizza una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale delside oppure 90°scatter • Anche l’ intensità del side scatter è proporzionale alladimensione, formaedomogeneitàottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

12. Il Forward Scatter tende ad essere più sensibile alle proprietà della superficie cellulare delle particelle del Side Scatter • può essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte • Il Side Scatter tende ad essere più sensibie alle inclusioni presenti all’interno della cellula del forward scatter • può essere usato per distinguere cellule granulate da cellulenon-granulate

13. Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico GRANULOCITI 90 Degree Scatter MONOCITI LINFOCITI Forward Scatter

14. Nuclei di linfociti normali o apoptotici 90 Degree Scatter Forward Scatter

15. Complex or Boolean Gating With two overlapping regions, several options are available: R1 R2

16. Boolean Gating Region 1 and Region 2:

19. Analisi citofluorimetrica DC CD11c+ CD11b+ pDC CD11c+ CD11b- FL2-H Macrophages CD11c- CD11b+ T cells CD11c- CD11b- B cells FL1-H FL1-H : CD11b FL2-H : CD11c

20. Analisi del ciclo cellulare

21. …

22. apoptosi

23. analisi al citofluorimetro

24. . singole

25. Il “sorting” cellulare

26. + FALS Sensor 488 nm laser FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Fluorescence detector - Piastre cariche elettricamente Cellule singole separate dentro diverse provette

27. Jet-in-Air Electrode Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v)

28. Jet-in-Air Electrode Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v)

29. Jet-in-Air +/- 190 V Fluorescence Delay Time Break-off Point Electrode Crystal Nozzle +++++++++ Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v)

30. Jet-in-Air _ _ + + - 3000 V + 3000 V

31. Analisi pre-sorter Macrofagi peritoneali CD11b positivi

32. Gating Macrofagi peritoneali CD11b positivi

33. Sorted CD11b HIGH sorted CD11b INT. sorted

34. Misurazione e uso di Abs • Saggio ELISA • ELISPOT • Cromatografia d’affinità • Western Blotting • Microscopia ad immunofluorescenza • Citometria a flusso

35. ELISA • Legame diretto con l’Ag • Sandwich

36. ELISAsandwich

37. ELISPOT

38. Western blotting

39. Cromatografia d’affinità

40. Magnetic sorting

41. miniMACS

42. Microscopia ad immunofluorescenza . . . . . .

43. Immuno Staining (anti-occludina) polilisina/vetrino conc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H2O 20 min. RT 2 lavaggi con H2O asciugare bene PREPARZIONE DEI CAMPIONI Seminare 1,5 x 105 cells/vetrino, in 70 µl di terreno NO siero Incubazione, 15 min 37ｰC (incubatore) Controllare al microscopio FISSARE LE CELLS Aspirare il surnatante Aggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4ｰC Lavare tre volte con PBS 1X (RT) A questo passaggio posso conservare i campioni (in PBS, 4ｰC) 1 COLORAZIONE Aspirare il PBS Permeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on ice. Washing 3X con PBS Blocking con 3%BSA in PBS, 15 min RT Washing 3x con PBS Primary Ab, anti-occludina (rabbit, 1 mg/ml, ZYMED, cat. N. 71.1500), usare 10 µg/ml finale in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino 1 h on ice Washing 3x con PBS Secondary Ab, a-rabbit, IgG, Cy3-conjugated (donkey Jackson Cod. n. 711.166.152). Suggested dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino. 30 min on ice, al buio. Washing 3x con PBS Montare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando 5-6 µl di moviol 30 min RT, buio Vetrino a – 20ｰC. 2