CARTOGRAPHIE PHYSIQUE CLONAGE POSITIONNEL

1. Consultez le site de Nicolas BERTRAND, vous y trouverez les articles que vous devrez présenter en trinome le 27 février avec Françoise MUSCATELLI

2. 1 M1 Génétique des Mammifères 2006 - LUMINY CARTOGRAPHIE PHYSIQUECLONAGE POSITIONNEL Laurent VILLARD Inserm Unité 491 Faculté de Médecine de La Timone http://www.team3-u491.net

3. 29 CARTES PHYSIQUES Etablir la carte physique d’un génome consiste à localiser les gènes, les marqueurs génétiques, le centromère etc… le long des chromosomes à leur position correcte. Il existe différentes résolutions pour une carte physique : Basse Chromosome Hybrides d’irradiation Contig de YACs Contig de cosmides Sequence Resolution Haute

4. 30 CARTES PHYSIQUES - HYBRIDATION IN SITU FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) Un fragment d’ADN (gène, marqueur etc…) est marqué avec une molécule fluorescente. Cette sonde est hybridée directement sur une préparation de noyau où les chromosomes sont en métaphase (et donc reconnaissables). Précision obtenue : environ 5 Mb (i.e. basse résolution) Il existe une technique de FISH sur fibre de chromatine étirée où la précision peut atteindre 10 kb mais on ne peut plus reconnaître le chromosome (cette technique est utilisée pour positionner les sondes les unes par rapport aux autres dans une région déjà cartographiée à basse résolution).

5. 4 5 1 2 3 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Y X 31 Caryotype humain standard

6. 32 Caryotype « spectral » - SKY (Spectral KarYotyping)

7. 33 Exemple de FISH utilisant deux sondes : 1- centromère du chromosome X (Xcen) 2- gène STS (Xp22.3) Délétion de la région contenant le gène STS Que se passe-t-il chez cet individu ?

8. 34 CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES Hybrides somatiques (SCH, Somatic Cell Hybrids) C’est le résultat de la fusion cellule humaine / cellule de rongeur. Certains chromosomes humains sont retenus par l’hybride. Fusion + Cellule humaine Cellule de rongeur Cellule de rongeur + chromosome(s) humains Le contenu chromosomique des hybrides est déterminé et ils sont ensuite utilisés pour localiser un gène, un marqueur… L’information obtenue est de l’ordre de la région chromosomique.

9. 35 CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES Exemple d’utilisation d’un « panel » de localisation Chromosomes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Hybride #1 + + + + + + + + Hybride #2 + + + + + + + Hybride #3 + + + + + Hybride #4 + + + + + + + + Hybride #5 + + + + + + + Hybride #6 + + + + + + + + Le gène testé par PCR sur l’ADN des hybrides donne un signal positif dans les hybrides 1 et 4. Tous les autres hybrides sont négatifs. Quel est le chromosome sur lequel est situé ce gène ?

10. 36 CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES Exemple d’utilisation d’un « panel » de localisation Chromosomes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Hybride #1 + + + + + + + + Hybride #2 + + + + + + + Hybride #3 + + + + + Hybride #4 + + + + + + + + Hybride #5 + + + + + + + Hybride #6 + + + + + + + + Le gène testé par PCR sur l’ADN des hybrides donne un signal positif dans les hybrides 1 et 4. Tous les autres hybrides sont négatifs. Quel est le chromosome sur lequel est situé ce gène ? Chr.18

11. 37 CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES d’IRRADIATON Une précision supérieure peut être obtenue en utilisant des cellules cellules humaines lourdement irradiées et fusionnées à des cellules de hamster (hybrides d’irradiation). Rayons X Fusion + Cellule humaine Cellule de rongeur Cellule de rongeur + Fragment(s) de chromosome(s) humains Deux marqueurs initialement localisés à proximité l'un de l'autre ont plus de chance d'être simultanément retrouvés dans les mêmes hybrides que deux marqueurs éloignés. Les distances se mesurent en centiray (cR).

12. 38 CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES d’IRRADIATON Il existe des hybrides d’irradiation pour plusieurs espèces : Homme ,vache, souris, rat, cochon, poisson zèbre, chien, cheval. La dose d'irradiation (rayons X) appliquée aux cellules humaines va conditionner la résolution de la carte : plus la dose de rayons est forte, plus les fragments générés sont petits et donc plus la résolution sera grande. Les doses varient de 3.000 à 50.000 rads, c’est-à-dire une taille moyenne des fragments allant de 10 Mb à 800 kb. Ces outils sont disponibles dans le commerce.

13. 39 Comparaison entre carte des hybrides d’irradiation et carte génétique (basse résolution) du chromosome 13 humain. La carte des hybrides d’irradiation est plus proche de la carte physique que de la carte génétique.

14. 43 CARTES PHYSIQUES - Les Contigs de Clones On utilise des clones afin d’isoler la région du génome qui nous intéresse et de disposer de l’ADN correspondant de manière illimitée (facile d’accès, reproductible). Un contig de clones est une série de fragments d’ADN clonés dont chacun chevauche son voisin dans l’ordre correct le long des chromosomes. Types de clones utilisés : Plasmides E. Coli - 10 kb --- Phages E. Coli - 20 kb --- Cosmides E. Coli - 40 kb - PACs E. Coli - 100 kb (80-150 kb) ++ BACs E. Coli - 150 kb (100-300 kb) +++ YACs S. cerevisiae - 1.000 kb (1 Mb) (0,5 - 2 Mb) +++

15. ! ! 47 CARTES PHYSIQUES - Marqueurs STS & EST STSs (Sequence Tagged Sites) Loci spécifiques pour lesquels suffisamment d’information de séquence est disponible pour faire des amorces PCR et amplifier le locus correspondant (quelques centaines de pb). La seule information nécessaire pour définir un STS est la séquence des amorces PCR. ESTs (Expressed Sequence Tag) Etiquettes spécifiques de chacun de gènes. Ils proviennent des informations de séquence des ADNc et donc représentent des séquences transcrites. Ils peuvent provenir du 3’, du 5’ d’un ADNc ou des deux côtés. Il existe plusieurs ESTs pour chaque gène.

16. 48

17. 53 CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome

18. 54 CARTES INTÉGRÉES

19. 55 CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome • Le génome humain est composé de 3.272 millions de nucléotides. • La taille moyenne d’un gène est de 3000 bases, mais la taille varie beaucoup (ex : le gène de la dystrophine a une taille de 2,4 millions de bases). • Le nombre total de gène se situe entre 25.000 et 30.000. • 99.9% des nucléotides sont identiques entre deux personnes. Il existe donc 0,1% de différences (soit environ 3,5 millions de différences par génome). • Plus de 50% des gènes ont une fonction inconnue.

20. 56 CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome • Les régions riches en gènes sont également les régions riches en nucléotides G/C • Les régions pauvres en gènes sont riches en A/T. Ces différentes régions peuvent généralement être visualisées comme des bandes claires ou sombres des chromosomes métaphasiques. • Le chromosome 1 contient le plus grand nombre de gènes estimés (environ 3000) tandis que le chromosome Y en a le moins (231). • Moins de 2% de l’ADN code pour des protéines. • Les séquences répétées composent environ 50% de la totalité du génome.

21. Cytogénétique 57 Points de cassure chromosomique STS Couverture basse resolution YACs Couverture Haute resolution Autres clones génomiques Contigs Cosmides Pathologies localisées Gènes clonés Marqueurs génétiques Marqueurs murins homologues Régions de synténie

22. 58 www.ensembl.org

23. 59 D7S1790 Statistiques

24. 60

26. CLONAGE POSITIONNEL

27. 61 • IDENTIFICATION DE GÈNES DE PATHOLOGIE • - Clonage Fonctionnel • - Clonage Positionnel • Approche gène candidat position-indépendant • - Approche gène candidat positionnel

28. Localisation sous-chromosomique connue Bases biochimiques de la pathologie connues CLONAGE POSITIONNEL Pathogenèse moléculaire connues pour des pathologies similaires (chez l ’Homme ou l ’animal) Idée générale de la pathogenèse moléculaire Produit du gène Essai fonctionnel APPROCHE GENE CANDIDAT POSITIONNEL APPROCHE GENE CANDIDAT INDEPENDANT DE LA POSITION CLONAGE FONCTIONNEL 62 Gène non identifié de la maladie

29. 63 Clonage Fonctionnel (exemples) - Hémophilie A Obtention de la séquence protéique du facteur VIII de porc. Obtention d ’oligonucléotides susceptibles de coder pour une partie de la séquence criblage d ’une banque d ’ADNc humaine avec des oligonucléotides - Phénylcétonurie L’enzyme responsable de la pathologie était connue (phénylalanine hydroxylase). L ’enzyme a été purifiée et des anticorps spécifiques ont été produits. Les anticorps ont servi à immunoprécipiter des polysomes contenant l ’ARN d ’intérêt. - Anémie de Fanconi groupe C Complémentation fonctionnelle par transformation de cellules déficientes avec des fragments d ’ADN générés au hasard jusqu ’à sauver le phénotype mutant.

30. 64 Les étapes d’un clonage positionnel 1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide 2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs 3- identifier tous les gènes présents dans la région 4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable

31. 65 Obtenir une localisation sous-chromosomique Analyse de liaison génétique Permet d’identifier un marqueur donnant un lod score supérieur à 3 dans des études familiales. C’est la plus utilisée des méthodes de localisation génétique. A1 A3 Marqueur lod score (Z) à q = 0 A - B 0.45 C 0.87 D -  B2 B3 gène muté C4 C7 D8 D9 A1 A A1 A3 B2 B2 B3 B2 Gène muté Gène muté C4 C4 C7 C7 D D9 D8

32. A3 A1 A3 A1 Apparition d’une mutation Sur l’haplotype A3-B4-C2-D7 B4 B2 B4 B2 Mutation C2 C6 C2 C6 D7 D1 D7 D1 66 Obtenir une localisation sous-chromosomique Mise en évidence d’un déséquilibre de liaison Il s’agit de l’association non aléatoire d’allèles pris à des loci différents. Les patients atteints d’une maladie ont hérité, d’un ancêtre commun, un segment de chromosome contenant le gène pathologique et les marqueurs qui lui sont liés sous leur forme allélique spécifique (ceux-ci sont donc en déséquilibre de liaison). Les allèles proches de la mutation (ex. B4 et C2) peuvent être transmis en même temps que la mutation et donc se retrouver en déséquilibre de liaison chez les individus atteints.

33. 67 Obtenir une localisation sous-chromosomique Mise en évidence d’une perte d’hétérozygotie (LHO - Loss of heterozygosity) Permet d ’identifier une région chromosomique délétée par analyse familiale de la transmission de marqueurs polymorphes.

34. 68 Obtenir une localisation sous-chromosomique Mise en évidence d’une anomalie chromosomique Permet de déterminer la région du génome impliquée dans une maladie. Les anomalies peuvent être de plusieurs types : inversions, translocations, délétions, duplications. TRANSLOCATION RÉCIPROQUE chromatide p centromère q b a t(a;b) chromosome

35. Obtenir une localisation sous-chromosomique

36. Cartographie d'exclusion

37. 69 Les étapes d’un clonage positionnel 1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide 2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs 3- identifier tous les gènes présents dans la région 4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable

38. 70 Les étapes d’un clonage positionnel 1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide 2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs 3- identifier tous les gènes présents dans la région 4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable

39. 71 Identifier les gènes dans la région d’intéret 1- Cartographie des îlots CpG 2- Sélection directe d’adn complémentaire 3- Recherche de séquences conservées au cours de l’évolution 4- Piégeage d’exons 5- Utilisation de méthodes bioinformatiques

40. 72 Identifier les gènes dans la région d’intéret 1- Cartographie des îlots CpG 2- Sélection directe d’adn complémentaire 3- Recherche de séquences conservées au cours de l’évolution 4- Piégeage d’exons 5- Utilisation de méthodes bioinformatiques

41. 73 www.ensembl.org

42. http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Registered/Webapp/nix/

43. 74 Les étapes d’un clonage positionnel 1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide 2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs 3- identifier tous les gènes dans la région d’intérêt 4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable

44. 75 Types d’anomalies moléculaires a l’origine d’une pathologie Anomalies structurelles délétions - insertions - expansions de triplet duplications translocations Anomalies d’expression du transcrit absence d’expression expression bi-allélique anormale Mutations ponctuelles mutations faux-sens mutations non-sens mutations d’épissage ?

45. 80 Comment savoir si une mutation est pathogène ? - cette mutation modifie-t-elle la protéine produite ? - cette mutation est-elle absente chez les individus normaux ? - une inactivation chez un animal modèle reproduit-elle le phénotype humain ? - peut-on complémenter le phénotype avec une copie normale du gène ?

46. 81 Le clonage d’un gène de pathologie permet - Conseil génétique risque de récurrence diagnostic prénatal - Corrélations génotype / phénotype - Analyse de la fonction normale et pathologique du produit du gène - Analyse de la protéine et de ses interacteurs potentiels - A terme, éventuellement, thérapie génique / pharmacologique

47. 82 Adresses électroniques utiles Chromosomes humains (cartographie) http://www.ornl.gov/hgmis/launchpad/ http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/human-gen-db-chromosomes.html Maladies génétiques http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.html http://bisance.citi2.fr/GENATLAS/ http://orphanet.infobiogen.fr/ http://www.icondata.com/health/pedbase/pedlynx.htm http://gdbwww.org/ Cartographie du génome humain - Marqueurs polymorphes http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/ http://genome.ucsc.edu/index.html http://www.ensembl.org/ http://www.chlc/org/ http://www.genethon.fr/ http://www.cephb.fr/ceph-genethon-map.html Bases de données de séquences http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/

48. EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989) La mucoviscidose (CF = cystic fibrosis) est la maladie génétique autosomique récessive mortelle la plus fréquente chez les caucasiens. La prévalence est de 1/2.000 nouveaux-nés. 1 adulte sur 22 est porteur de l'allèle mutant ! Le gène CF a été le troisième gène isolé grâce au clonage positionnel (après celui de la granulomatose chronique et celui de la myopathie de Duchenne).

49. EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989) Il n'y avait aucun remaniement chromosomique disponible pour localiser le gène, et il n'existait pas de carte très précise du génome à l'époque (ni génétique, ni physique). Le gène CFTR a été localisé initialement en 7q21 parce qu'il co-ségrégeait avec deux marqueurs RFLP (les seuls disponibles à l'époque). Ces marqueurs ont été utilisés comme points de départ pour isoler des clones d'ADN de la région concernée et pour reconstruire la carte physique de la région. Le gène a été identifié en utilisant différentes méthodes (zoo blots, northern blots et criblage de banques d'ADNc fabriquées à partir de patients CF).

50. EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)