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Les gènes et les mutations responsables de l'évolution morphologique

Les gènes et les mutations responsables de l'évolution morphologique Virginie Orgogozo (CNRS-UPMC) Avril 2009 Module de l’École Doctorale du Muséum. How did evolution give rise to human beings?. ?. Natural history observations from the 17th, 18th and 19th centuries.

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Les gènes et les mutations responsables de l'évolution morphologique

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Presentation Transcript

  1. Les gènes et les mutations responsables de l'évolution morphologique Virginie Orgogozo (CNRS-UPMC) Avril 2009 Module de l’École Doctorale du Muséum

  2. How did evolution give rise to human beings? ?

  3. Natural history observations from the 17th, 18th and 19th centuries Mendelian genetics Ecology Systematics Biogeography Today Molecular Biology Developmental Biology Genomics incorporating the precise genes and mutations responsible for evolution ~1859 Theory of evolution selection of the fittest individuals, heritable variation ~1920-40 Modern Evolutionary Synthesis changes in allele frequencies, selection coefficients, etc.

  4. ? What are the mutations responsible for phenotypic differences? - To better understand evolution

  5. ? What are the mutations responsible for phenotypic differences? - To better understand evolution - To better understand population variation - To identify “remarkable” genes

  6. Genomic approach identifies rapidly-evolving genomic regions, new genes, deleted genes ? Phenotypic approach ? identifies the gene(s) and the mutation(s) responsible for a phenotypic change What are the mutations responsible for phenotypic differences? Genomes Phenotypic differences CCTCCTCCATACCCAAATGGATGGTACGGCATTCTTGAATCATCAAAGCT TAGAGCGGGGGAATCGAAGCATATATCATGTCTAGGCGAGCAACTTATAG TGTTCCGTTCCCAAGCTGGTGAAGTTTATATCTTGGATGCGTATTGCCCG CACTTGGGCGCTAATTTGAGTAAGGGAGGTCGAGTTATAGGAGATAATAT TGAATGTCCCTTTCACCACTGGAGCTTTAGAGGCAGTGATGGCATGTGTA CCAATATTCCCTACAGCAGCAATATACACTCATCTACAAAAACTAAAAAA TGGACCTCCACCGAAGTGAATGGATTCATATTTCTTTGGTACAATGTCGA AGAATCTGAAGTTCCGTGGAATATACCAAAATCAGTTGGTGTTGCAAAAA CCTCCTCCATACCCAAATGGATGGTACGGCATTCTCGAATCATCAAAGCT TAGAGCGGGGGAATCGAAGCATATATCATGTCTAGGCGAGCAACTTATAG TGTTCCGTTCCCAAGCTCGTGAAGTTTATATCTTGGATTCGTATTGCCCG CACTTGGGCGCTAATTNGAGTAAGGGAGGTCGAGTTATAGGAGATAATAT TGAATGTCCCTTTCACCACTGGAGCTTTAGAGGCAGTGATGGCATGTGTA CCAATATTCCCTACAGCAGCAATATACACTCATCTACAAAAACTAAAAAA TGGACTTCCACCTAAGTGAATGGATTCATATTTCTCTGGTACAATGTCGA AGAATCTGAAGTTCCGTGGAATATACCAAAATCAGTTGGTGTTGCAAAAA

  7. What are the mutations responsible for phenotypic differences? Genomic approach identifies rapidly-evolving genomic regions, new genes, deleted genes ? Genomes Phenotypic differences CCTCCTCCATACCCAAATGGATGGTACGGCATTCTTGAATCATCAAAGCT TAGAGCGGGGGAATCGAAGCATATATCATGTCTAGGCGAGCAACTTATAG TGTTCCGTTCCCAAGCTGGTGAAGTTTATATCTTGGATGCGTATTGCCCG CACTTGGGCGCTAATTTGAGTAAGGGAGGTCGAGTTATAGGAGATAATAT TGAATGTCCCTTTCACCACTGGAGCTTTAGAGGCAGTGATGGCATGTGTA CCAATATTCCCTACAGCAGCAATATACACTCATCTACAAAAACTAAAAAA TGGACCTCCACCGAAGTGAATGGATTCATATTTCTTTGGTACAATGTCGA AGAATCTGAAGTTCCGTGGAATATACCAAAATCAGTTGGTGTTGCAAAAA CCTCCTCCATACCCAAATGGATGGTACGGCATTCTCGAATCATCAAAGCT TAGAGCGGGGGAATCGAAGCATATATCATGTCTAGGCGAGCAACTTATAG TGTTCCGTTCCCAAGCTCGTGAAGTTTATATCTTGGATTCGTATTGCCCG CACTTGGGCGCTAATTNGAGTAAGGGAGGTCGAGTTATAGGAGATAATAT TGAATGTCCCTTTCACCACTGGAGCTTTAGAGGCAGTGATGGCATGTGTA CCAATATTCCCTACAGCAGCAATATACACTCATCTACAAAAACTAAAAAA TGGACTTCCACCTAAGTGAATGGATTCATATTTCTCTGGTACAATGTCGA AGAATCTGAAGTTCCGTGGAATATACCAAAATCAGTTGGTGTTGCAAAAA ? Phenotypic approach identifies the gene(s) and the mutation(s) responsible for a phenotypic change

  8. Étude de 4 exemples Méthodes d’identification des gènes responsables de l’évolution morphologique Principes généraux concernant les gènes et les mutations responsables de l’évolution morphologique

  9. Forme des tomates Lycopericon esculentum Lycopersicon esculentum cv.Yellow Pear (Ku et al., 1999; Liu et al., 2002)

  10. Cartographie de QTL L. esculentum cv.Yellow Pear L. pimpinellifolium parents F1 gametes 82 individus F2 QTL? phenotype

  11. Mesure quantitative du phénotype Mesure de deux indices, L/D et Dmin/Dmax pour 10 fruits par plante L/D : L= longueur, D = diamètre à l’équateur Dmin/Dmax L D

  12. 82 marqueurs moléculaires sur les 12 chromosomes de tomate

  13. Un locus majeur près du marqueur TG645 L/D Dmin/Dmax responsable de 67% de la variance de L/D allèle YP = récessif

  14. Développement de nouveaux marqueurs moléculaires pour génotyper les recombinants précédents: Banque de BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) contient des fragments d’ADN génomique de tomate de 100-350kb Crible de la banque avec le marqueur TG645 BAC19 contenant 105kb, 17 ORF (open reading frame) TG645 BAC19

  15. ORF6 X Hypothèse: le gène responsable est ORF6 = OVATE 55kb, 8 ORF Séquençage de cette région chez les 2 tomates : 1 SNP (single nucleotide polymorphism) et 1 indel (insertion-deletion) de 2bp dans les régions non codantes 1 SNP dans l’ORF6 : G496T, codon stop, protéine tronquée avec les 75 derniers acides aminés manquants L. esculentum cv.Yellow Pear L. esculentum

  16. Complémentation de la mutation par transgénèse variété TA496 variété TA503 TA503 +OVATE TA503 +35S::OVATE promoteur de OVATE OVATE promoteur 35S OVATE Le gène responsable est OVATE/ORF6 Même mutation dans 3 autres variétés de tomate poire OVATE = protéine à domaine NLS (nuclear localisation signal), fonction inconnue, exprimée dans les fruits en développement mais pas dans l’appareil végétatif

  17. Tableau récapitulatif

  18. Couleur des organes bioluminescents de coléoptères organes bioluminescents dorsaux organes bioluminescents ventraux Pyrophorus plagiophthalamus Pyrophorus plagiophthalamus JV: organe ventral jaune vert Pyrophorus plagiophthalamus OR: organe ventral orange (Wood et al., 1989; Stolz et al., 2003)

  19. Polymorphisme et géographie Capture des coléoptères sur 3 sites en Jamaïque Mesure de la bioluminescence de l’organe ventral

  20. Test d’un gène candidat: la luciférase Gène isolé chez les lucioles

  21. Test d’un gène candidat: la luciférase Gène isolé chez les lucioles Luciférase = enzyme qui catalyse une réaction bioluminescente Luciférine = substrat Réaction en deux étapes: luciferin + ATP → luciferyl adenylate + PPi luciferyl adenylate + O2 → oxyluciferin + AMP + photon Utilisé comme gène rapporteur

  22. Test d’un gène candidat: la luciférase Extraction des ARNm des organes bioluminescents dorsaux Extraction des ARNm des organes bioluminescents ventraux Production d’ADNc, banque d’ADNc Crible de la banque avec un anticorps anti-Luciférase de luciole Séquençage des clones Production d’amorces spécifiques du gène de Pyrophorus plagiophthalamus luciférase

  23. Extraction des ARNm des organes bio- luminescents dorsaux luciférase ADNc RT-PCR Extraction des ARNm des organes bio- luminescents ventraux séquençage clonage analyse spectrophotométrique des clones de bactéries E. coli

  24. À chaque couleur correspond une séquence allèles OR Organes ventraux allèles J allèles VJ allèles VJ Organes dorsaux allèles V

  25. À chaque couleur correspond une seule séquence allèles J allèle OR Seulement 2 mutations trouvées dans toutes les séquences des allèles OR: T739G et C740G dans l’exon4, conduisant au changement d’un acide aminé

  26. Tableau récapitulatif

  27. Trichomes D. sechellia D. melanogaster D. mauritiana D. simulans (McGregor et al., 2007)

  28. The D. melanogaster species subgroup D. melanogaster D. mauritiana D. simulans D. sechellia D. teissieri D. yakuba D. santomea D. orena D. erecta genome sequenced

  29. 2 Correlation between expression pattern and phenotype D. melanogaster D. sechellia D. melanogaster D. sechellia 3 The mutation maps to the X chromosome 4 Complementation assay with D. melanogastersvbWT or svb- hybrids D. mel./D.sech. svb- x D. mel. D. mel. D. sech. D. sech. Evolution caused by a change in the svb gene 1 Transcription factor that promotes trichome formation (Sucena and Stern, 2000)

  30. recombination mapping D. mauritiana D. sechellia x P[w+] P[w+] svb svb 1.2 Mb selection of recombinants based on eye color Where is the cis-regulatory mutation? enhancer bashing 50 kb reporter

  31. Among progeny individuals: select[orange eye]flies: 3/100 flies

  32. One recombination event every 2kb D. mauritiana D. sechellia x P[w+] P[w+] svb svb 1.2 Mb 1 selection of 600 recombinants based on eye color 100 kb svb

  33. D. mauritiana D. sechellia D. mauritiana- like D. sechellia- like

  34. Five types of recombinants D. mauritiana D. sechellia D. mauritiana- like D. sechellia- like Three new phenotypes

  35. 50 kb reporter D. sechellia Three enhancer regions reporter D. melanogaster

  36. 50 kb Three enhancer regions reporter D. melanogaster reporter D. sechellia

  37. Multiple incremental mutations at a single gene

  38. Tableau récapitulatif

  39. Nombre de soies thoraciques Marcelini 2006 - PLoS Biol. 4, e386

  40. Entre D. melanogaster et D. quadrilineata Environ 60 000 000 ans entre D. melanogaster et D. quadrilineata Marcelini 2006 - PLoS Biol. 4, e386

  41. Modèle général de formation des organes sensoriels Gènes impliqués Gènes de prépattern = gènes des voies de signalisation (Wnt, TGF, etc.) + facteurs de transcription Gènes proneuraux = achaete, scute, lethal of scute, atonal, amos = facteurs de transcription Gènes de spécification des cellules précurseurs = Senseless, Cut, etc. = facteurs de transcription Gènes de la voie de signalisation Notch Gènes impliqués dans les divisions cellulaires asymmétriques Gènes de différentiation (tubuline, actine, Or, Gr, etc.) Ghysen et Dambly-Chaudière 1989 - Trends Genet 5, 251-5

  42. http://www.swarthmore.edu/ Développement de D. melanogaster

  43. scute dans le disque imaginal d’aile : (hybridation in situ) Région cis-régulatrice de scute : Enhancer DC Marcellini 2006 - PloS Biology 75kb 0kb Développement des soies thoraciques adulte larve de 3e stade aDC DC pDC PA SC aSC pSC futur thorax future aile Simpson 2007 - Trends in Genetics

  44. Entre D. melanogaster et D. quadrilineata Dû à une différence d’expression du gène scute ? Hybridation in situ des disques imaginaux d’aile :

  45. Région cis-régulatrice de scute : Enhancer DC 75kb 0kb Développement des macrochètes thoraciques chez D. melanogaster adulte larve de 3e stade aDC DC pDC PA SC aSC pSC futur thorax future aile Simpson 2007 - Trends in Genetics

  46. Enhancer DC de D. melanogaster scute Enhancer DC de D. quadrilineata scute Dû à une différence dans le promoteur du gène scute ?

  47. Dû à une différence dans le promoteur du gène scute ? Enhancer DC de D. melanogaster B-galactosidase Enhancer DC de D. melanogaster GFP Enhancer DC de D. melanogaster B-galactosidase Enhancer DC de D. quadrilineata GFP

  48. Analyse informatique de l’enhancer DC du gène scute Site de liaison à Pannier indispensable au bon fonctionnement du DCE de D. melanogaster Sites de liaison à Pannier

  49. Tableau récapitulatif

  50. Méthodes pour identifier les mutations responsables de l’évolution

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