Каменский Петр Андреевич pkame@list.ru

1. Импорт биомакромолекул в митохондрии Митохондриальные болезни и их лечение Каменский Петр Андреевич pkame@list.ru

2. Транслоказа внутренней мембраны TIM23 TIM23-комплекс осуществляет (1) транспорт белков в митохондриальный матрикс и (2) встраивание некоторых белков во внутреннюю мембрану.

3. Коровый комплекс TIM23 (TIM23CORE) • Tim17 и Tim23 формируют канал • Tim50 поддерживает канал в закрытом состоянии в отсутствие предшественников • Tim21 (неконститутивный компонент TIM23CORE) связывается с Tom22 и облегчает перенос предшественников с TOM- на TIM23-комплекс.

4. Стадии транслокации предшественников через TIM23-комплекс в матрикс 1. Pam17, связываясь с TIM23-комплексом со стороны матрикса, стимулирует высвобождение Tim21 и проникновение сигнальной последовательности предшественника в матрикс.

5. Стадии транслокации предшественников через TIM23-комплекс в матрикс 2. К комплексу со стороны матрикса привлекаются белки Pam16, Pam18 и Tim44. После этого Pam17 спонтанно отсоединяется от комплекса.

6. Стадии транслокации предшественников через TIM23-комплекс в матрикс 3. Предшественник частично проникает в матрикс, где к его сигнальной последовательности присоединяется шаперон mtHsp70, который, вместе с Tim44, обеспечивает проникновение в матрикс остальной части белка.

7. Мотор импорта белков в митохондрии: как же он работает? В результате гидролиза АТФ mtHsp70 связывается с импортируемым белком и претерпевает структурные изменения, в результате чего «наклоняется» перпендикулярно мембране. Таким образом, белок «протаскивается» в матрикс.

8. Мотор импорта белков в митохондрии: как же он работает? Импортируемый белок совершает «статистические» движения в канале. Как только белок немного продвинулся в сторону матрикса, с ним связывается молекула mtHsp70, и это запрещает движение белка в обратную сторону. Процесс повторяется много раз, в результате чего белок оказывается целиком в матриксе. В настоящее время неизвестно, какая именно из двух моделей реализуется при импорте белков в митохондрии.

9. Транслокация предшественников через TIM23-комплекс во внутреннюю мембрану Некоторые белки встраиваются во внутреннюю мембрану непосредственно из TIM23-комплекса. Этот процесс не требует участия АТФ и обеспечивается только мембранным потенциалом.

10. Общая схема работы TIM23-комплекса

11. Транслоказа внутренней мембраны TIM22 • TIM22-комплекс встраивает во внутреннюю мембрану интегральные белки (например, АТФ/АДФ-переносчик). • Tim22 – канальный белок • Tim54 привлекает к комплексу малые Tim-белки • Tim18 и Sdh3 участвуют в сборке комплекса и регулируют его стабильность

12. Схема встраивания интегральных белков во внутреннюю мембрану • Белок в цитозоле связывается с рецептором Tom70 • Белок транспортируется через внешнюю мембрану • В межмембранном пространстве с белком связываются малые Tim-белки: Tim9 и Tim10 • Эти белки переносят белок к TIM22-комплексу, он встраивается в канал, после чего происходит его латеральное открывание, и белок встраивается в мембрану

13. Отщепление сигнальных последовательностей импортируемых белков В настоящее время более или менее подробно описан только механизм отщепления N-концевых сигнальных последовательностей посредством MPP.

14. Общая схема отщепления сигнальных последовательностей

15. Импорт РНК в митохондрии

16. Импорт РНК в митохондрии – видоспецифичный процесс В митохондрии могу импортироваться тРНК, 5S рРНК, а также РНК-компоненты РНКаз P и MRP (у млекопитающих)

17. Импорт тРНК в митохондрии 1. Как происходит разделение тРНК на импортируемые и неимпортируемые? 2. Как тРНК попадают к поверхности митохондрий? 3. Как происходит собственно транслокация тРНК через мембраны органеллы? 4. Имеет ли место регуляция этого процесса, и если да, то как она осуществляется?

18. Нуклеотидные детерминанты/антидетермининты импорта тРНК в митохондрии Универсальных нуклеотидных детерминант не имеется.

19. Другие необходимые условия импорта РНК

20. Импорт тРНК в митохондрии простейших Даже внутри группы простейших механизмы импорта тРНК различаются.

21. Импорт тРНК в митохондрии простейших • Импортируются все элонгаторные тРНК • Для доставки тРНК к поверхности митохондрий необходим eEF1а • VDAC не принимают участия в импорте; мембранные белки, обеспечивающие импорт, неизвестны

22. Chlamydomonas – интересный случай импорта тРНК в митохондрии Эффективность импорта различных тРНК составляет от 0 до 100%... …и коррелирует с частотой использования соответствующих кодонов в митохондриях!

23. Импорт тРНК в митохондрии растений • Растворимые цитозольные белки не требуются • Показаны три компонента внешней мембраны, принимающие участие в импорте: Tom40, Tom20, VDAC • Белки внутренней мембраны, необходимые для импорта, неизвестны

24. CCA-OH CCA-OH CCA-OH A G U G - C Y - A G - C A - U C - G C - G G - C C - G C - G A - U U - A U - G A - U U - G U - A U - A G - Y G - C A - U C U - A U U - A (m1A) A U G G (m1A) U A C A C C G A C C G A A A U A U A D D G U C C C C A U C C C C D m2 A G U U U G C U C G C G C G D G m2 C m2 G G C U G G C A G G G G A G G G G T C G G C T T Y U A A A C G A G C 2 G C G C Y Y G 2 U U A G G G C A G A m2 A m2 D 5 U D D G - C A A A Y - A Y - A C D U G C Y - A - A A - U Y m7 G G m7 U - A C - G U - A G - C G - C G - C Y - G G - C A - Y C A A A C C U A U A U A t6 t6 t6 5 2 5 U** U U* U C U U*=mnm S U U U**=cmnm U U U тРЛ3 тРЛ2 тРЛ1 Закодир. в ядерной ДНК Закодир. в ядерной ДНК Закодир. в 95% в цитозоле митохондр. ДНК 5% в митохондриях 100% в цитозоле 100% в митохондриях Импорт тРНК в митохондрии дрожжей Наиболее хорошо изученная система импорта РНК в митохондрии.

25. Необходимые условия импорта тРЛ1: • Нуклеотидные детерминанты импорта • 2. Третичная структура тРНК • 3. АТФ и мембранный потенциал • 4. Белки-компоненты аппарата • импорта белков в митохондрии и/или порины • 5. Растворимые цитозольные белки: • - цитоплазматическая лизил-тРНК- • синтетаза (Krs1p) • - энолаза 2 (Eno2p) • - предшественник митохондриальной • лизил-тРНК-синтетазы (preMsk1p)

26. Енолаза-2 меняет структуру импортируемой тРНК

27. Схема событий в цитозоле, предшествующих импорту тРНК в митохондрии дрожжей

28. CCA-OH CCA-OH CCA-OH A G U G - C Y - A G - C A - U C - G C - G G - C C - G C - G U - A U - G U - G U - A U - A G - Y G - C A - U A - U U - A U U - A U A - U A C G A C C G A A U A U D A D G A U D m2 U U U G C U C G D m2 C m2 C G G C U G G (m1A) G G A (m1A) U A C A G C A G U U C C C C C C C C A A A C G A G C 2 2 G A U U A G G C G A C G C G G G G A m2 m2 D A 5 U D D G - C C A A G G G G A G G G G A Y - A T C C C D T T Y U G C Y Y G C G C Y - A - A Y A - U m7 G Y - A U - A C - G U - A G G - C G - C m7 G - C Y - G G - C A - Y A C A C C A A U A U A t6 t6 U t6 U* U C U U U U** U U тРЛ3 тРЛ2 тРЛ1 mcm5S2U ? AAA / AAG AAG AAA Роль тРЛ1 в митохондриях - ??? cmnm5S2

29. Адаптационный механизм митохондриальной трансляции дрожжей при повышенных температурах роста тРЛ3 при 37С гипомодифицируется по wobble-положению антикодона, в связи с чем становится неспособной распознавать AAG-кодоны. В этих условиях присутствие тРЛ1 в митохондриях становится необходимым.

30. Импорт 5S рРНК в митохондрии млекопитающих

31. Нуклеотидные детерминанты/антидетерминанты импорта 5S рРНК

32. Белковые факторы импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека • Белок preMRP-L18 обеспечивает связывание 5S рРНК с роданезой • Роданеза, связываясь с 5S рРНК, меняет свою конформацию и становится способной (видимо, в комплексе с 5S рРНК) проникать через внешнюю мембрану

33. 5S рРНК входит в состав миторибосом клеток человека 5S рРНК детектируется только в присутствии обеих субъединиц. Видимо, их диссоциация приводит к высвобождению 5S рРНК из митохондриальных рибосом.

34. Полинуклеотидфосфорилаза (PNPase) – регулятор импорта РНК в митохондрии млекопитающих

35. Митохондриальные болезни и их лечение

36. Митохондриальный геном человека 13 белков, 22 тРНК, 2 рРНК

37. Respiratory Failure Optic Atrophy / Retinitis Pigmentosa CVA / Seizures / Dev. delay Cardiomyopathy Deafness Liver Failure Peripheral Neuropathy Short Stature Marrow Failure Myopathy Diabetes ThyroidDisease Мутации в мтДНК и их фенотипические проявления

38. Мутации в мтДНК встречаются у каждого 500-го жителя Земли (гетероплазмия)

39. Способы супрессии мутаций в митохондриальном геноме Мутация в гене тРНК / протяженная делеция Мутация в гене белка Мутация в гене рРНК Импорт соответствующего белка с сигнальным пептидом из цитозоля ? Импорт РНК в митохондрии На сегодняшний день все работы по супрессии таких мутаций сделаны ТОЛЬКО на культурах клеток человека (ни доклиники, ни клиники не делалось).

40. Импорт производных дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с мутациями в генах изоакцепторных тРНК А. Мутация в гене тРНК(Лиз) вызывает синдром MERRF

41. Импорт производных дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с мутациями в генах изоакцепторных тРНК Б. Мутация в гене тРНК(Лей) вызывает синдром MELAS

42. 2. Импорт «мини-версий» дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с протяженной геномной делецией Вставочная последовательность «мини-РНК» комплементарна участку митогенома, образующемуся в результате делеции.

43. 2. Импорт «мини-версий» дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с протяженной геномной делецией «Мини-РНК», импортируясь в митохондрии клеток человека, связываются только с мутантными митохондриальными ДНК и блокируют их репликацию. В результате снижается уровень гетероплазмии, и клетки практически «выздоравливают».

44. 3. Опосредованный ферментом PNPase импорт гибридных РНК в митохондрии клеток человека РНКаза Р При слиянии митохондриальных тРНК с «сигнальной» последовательностью, узнающейся PNPase, гибридные тРНК импортируются в митохондрии и частично супрессируют мутации, приводящие к развитию синдромов MERFF и MELAS.