Nové laboratorní metody v patologii

1. Fingerlandův ústav patologie Lékařská fakulta UK a Fakultní nemocnice Nové laboratorní metody v patologii

2. patologie • klasické pojetí: autopsie + nekroptická histopatologie • nové pojetí: biopsie na prvním místě! • při zpracování materiálu časté uplatnění automatů • nové informační systémy (počítačové databáze, kartotéky, propojování jednotlivých oddělení...)

3. vzorek pro bioptické vyšetření • odběr tkání k bioptickému vyšetření: • operace: odběr velkých částí tkáně, často následuje až v druhé době, po některém z dále uvedených • samovolné vyloučení: krev, hlen, sputum... • probatorní excize (zkusmé vyříznutí): u klinicky nejasných nálezů, další postup závisí na výsledku bioptického vyšetření • probatorní punkce (zkusmé nabodnutí tlustou jehlou): obdobné předchozímu, hlavně u těžko dostupných oblastí (mediastinum, retroperitoneum...) • kyretáž (výškrab): dutina děložní, procesy v kostech... • endoskopická excize: odběr tkáně v průběhu vyšetření dutých orgánů fibroskopy

4. vzorek pro bioptické vyšetření • materiál k bioptickému vyšetření: tkáně nefixované x fixované • fixační činidla: • 10% formalin (= 4% roztok formaldehydu): nejpoužívanější, vhodný pro klasickou světelnou mikroskopii a imunohistochemické vyšetření, dlouhodobé uchování tkání • absolutní ethanol: možno použít pro vyšetření tkáně molekulárními metodami • glutaraldehyd: pro elektronovou mikroskopii, pouze krátkodobé uchování tkání • kryokonzervace (zmražení při -72st.C): dlouhodobé uchování tkání, použitelné pro molekulární metody

5. vzorek pro bioptické vyšetření • dostatečné množství fixativa – 10 až 20 násobek objemu tkáně!!! • fixace matriálu ihned!!! • vhodná přepravní nádoba • materiál obklopen fixativem ze všech stran • snadná manipulace s materiálem (tkáň po fixaci ztuhne ve výchozím tvaru!) • označení materiálu • bioptická průvodka • označení materiálu (štítek s čitelnými údaji: jméno, příjmení, RČ, odesílající oddělení a klinika)

6. vzorek pro bioptické vyšetření • příjem materiálu na oddělení patologie → bioptické číslo • neustálá kontrola, vyvarování se záměny!

7. vzorek pro bioptické vyšetření • zpracování materiálu pro vyšetření světelným mikroskopem: • blokování: z větších částí tkání zhotovení bloků cca 1,5 x 1 x 0,5 cm • odvodnění a prosycení parafinem • krájení: řezy 5-7 μm • odparafinování, zavodnění a barvení: • hematoxylin-eozin: nejběžnější • další speciální metody

8. světelná mikroskopie • stavebnicový model mikroskopu – možnost přidávat další zařízení dle potřeby, bez nutnosti pořizování celého nového mikroskopu (speciální typy objektivů, kamery...) • morfometrie – speciální software pro kvantifikaci obrazových údajů (průměr, plocha...) • diskuzní zařízení – „vícehlavé“ mikroskopy (konzultace, výuka...) • telepatologie, virtuální preparáty... – speciální vybavení a software, možnost konzultovat nejasné či zajímavé případy i na velkou vzdálenost, rychlé, bez nutnosti odesílat skla či tkáňové bločky

9. elektronová mikroskopie • speciální, náročná příprava materiálu • dnes hlavně pro: • ledviny – glomerulonefritidy • střevo – céliakie • průkaz virů a některých parazitů • +/- vyšetření krve – vlasatobuněčná leukémie • technika: prozařovací, rastrovací

10. histochemie • průkazy enzymů u vrozených chorob

11. imunohistochemie • průkazy antigenů pomocí vazby značených protilátek • metody: a) přímá imunofluorescence: • nativní (nefixované) preparáty • navázání protilátky značené fluorochromem → sledování ve fluorescenčním mikroskopu b) nepřímá imunofluorescence: • značená je až sekundární protilátka (protilátka proti primární protilátce) – znásobení signálu • u tkání fixovaných formalinem c) nepřímá imunohistochemie: • sekundární protilátka je označená enzymem (křenová peroxidáza) → po reakci s chromogenem (barvivo) → výsledná, barevně stálá reakce (hnědá, červená)

12. molekulární metody • FISH, CISH • PCR • FACS • cytogenetika

13. molekulární metody...ISH ISH = in situ hybridizace • použití značených sond, které se naváží (hybridizují) na odpovídající (komplementární) úseky nukleových kyselin • sondy značené barvivem (CISH) či fluorescenčním barvivem (FISH) • např.: • karcinom prsu: amplifikace genu HER2/neu

14. molekulární metody...PCR PCR = polymerázová řetězová reakce • amplifikace (zmnožení) hledaných úseků DNK a jejich identifikace, např. elektroforézou

15. molekulární metody...FACS FACS = průtoková cytometrie • buňky značeny fluorescenčními barvivy → průchod tenkou kapilárou se současným snímáním fluorescenčních signálů • umožňuje současnou detekci několika antigenů na jedné buňce (x imunohistochemie – většinou pouze jeden antigen) • kromě kvalitativní analýzy (přítomnost markeru ano či ne?) i kvantifikace (kolik buněk má dané vlastnosti? • např.: • hematologická onemocnění

16. molekulární metody...cytogenetika chromozomální analýza, klasická cytogenetika • změny v počtu a uspořádání chromozomů • např.: • Downův syndrom: trizomie 21 • chronická myeloidní leukémie: translokace 9;12 = Philadelphia chromozóm

17. cytologie • viz samostatný seminář

18. literatura • Bártová, J.: Patologie (pro bakalářské studium ošetřovatelství), Praha, Karolinum, 1996 • Bednář, B. a kol.: Patologie I-III, 2. vyd., Praha, Avicenum, 1982 • Cotran, RS., Kumar, V., Robbins, SL.: Robbins Basic Pathology. 7th ed. Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo: W.B. Saunders Company, 2003 • Mačák, J., Mačáková, J.: Patologie, Praha, Grada, Avicenum, 2004 • Povýšil, C., Šteiner I., Dušek, J.: Speciální patologie I. díl, 1. vyd., Praha, Univerzita Karlova – Karolinum, 1995 • Povýšil, C., Šteiner I., Dušek, J.: Speciální patologie III. díl, 1. vyd., Praha, Univerzita Karlova – Karolinum, 1999 • Povýšil, C., Stejskal, J., Kodet, R., Povýšilová, V., Motlík, K., Chlumská, A., Pastrňák, A., Dudorkinová, D. .: Speciální patologie II. díl, 1. vyd., Praha, Univerzita Karlova – Karolinum, 1997