2. laboratorijas darbs. Olbaltumvielu spektro- fotometriska noteikšana.

1. Studiju kurssBioloģija laboratorijā BloksŠūnas bioloģija, bioķīmija, ģenētika 2. laboratorijas darbs. Olbaltumvielu spektro- fotometriska noteikšana. Māris Lazdiņšlazda@latnet.lv LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. Kas ir gaisma? Elektromagnetisko starojumu pēc tā - īpašībām un - mijiedarbības ar dzīvās un nedzīvās dabas objektiem iedala vairākos diapazonos:  diapazons 10 km – 1 mm - radiodiapazons 1 mm – 800 nm - infrasarkanais starojums 800 nm – 350 nm - redzamā gaisma 350 nm – 1 nm - ultravioletais starojums 1 nm – 10 pm - rentgena starojums 10 pm – 100 fm -  starojums LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Kas ir gaisma?  krāsa 760 nm – tumši sarkans 660 nm – sarkans 590 nm – oranžs 560 nm – dzeltens 500 nm – zaļš 480 nm – gaiši zils 450 nm – zils 380 nm – violets LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? I1 I2 Transmisija – (T = I2/I1) Transmisijas % – T% = (I2/I1)  100 Transmisijas% parāda cik % starojuma izkļuvuši cauri videi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Sakarību apraksta Bera likums: T=10-kcl k – konkrētai vielai raksturīgs starojuma absorbcijas koeficients pie noteikta starojuma ; c – vielas koncentrācija šķīdumā; l – starojuma ceļš cauri šķīdumam. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Praksē bieži izmanto Lamberta – Bera likumu un mērvienības: Absorbcija (A) Optiskais blīvums (D; OD) Ekstinkcija (E) A = - lg(T) = kcl LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā? Spektrofotometrs (SF) Kivete ar paraugu Starojuma intensitātes mērītājs Starojuma avots Kondensors Dispersijas sistēma Optiskā sprauga LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā? Fotoelektrokolorimetrs (FEK) Kondensors Optiskie filtri Starojuma avots Kivete ar paraugu Starojuma intensitātes mērītājs LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Pie darba ? LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. Ūdens un sausnas satura noteikšana LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Proteīnu kvantitatīva noteikšana Pamatā - krāsu reakcija Bradfordas + proteīni => zils krāsojums reaģents (mērījumiem izdevīgs (brūns)  = 590 nm - oranža gaisma) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. Proteīnu kvantitatīva noteikšana http://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay http://www.histosoft.com/services/background/ba/baback.html#ref LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 1. etaps - reakcijas “kalibrēšana” Reakciju veic ar zināmas koncentrācijas proteīnu (BSA) šķīdumiem, - lai iegūtu OD sakarību ar proteīnu koncentrāciju. 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,8 mg/ml. Ar katras koncentrācijas šķīdumu veic 2 atkārtotas reakcijas/mērījumus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 1. etaps - reakcijas “kalibrēšana” Reakcijas gaita: 1. Kivetē iepilda 2 ml Bradfordas reaģents (2 reizes pa 1000 l). Kivetes ņemt aiz rievotajām malām! Sekojiet, lai gaismas ceļā neievietotu kivetes matētās malas! Pārbaudiet vai FEK uzstādīts oranžais filtrs. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 1. etaps - reakcijas “kalibrēšana” 2. Nospiežot pogu „R“, aparātu iestāda uz D = 0 (T% = 100). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 1. etaps - reakcijas “kalibrēšana” 3. Izņem kiveti un pievieno 20 l proteīnu šķīdumu. 4. Ar 1000 µl automātiskās pipetes palīdzību (iesūcot un izpūšot) samaisiet šķīdumus un ielieciet kiveti FEK. 5. Pēc 1 minūtes izdara mērījumu, nospiežot taustiņu „T“. 6. Rezultātu pierakstiet 2. tabulā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Proteīnu kvantitatīva noteikšana • 1. etaps - reakcijas “kalibrēšana” • Katrai reakcijai jālieto jauna kivete! • Katrai kivetei ar reaģentu individuāli jāiestāda OD = 0,00 • (nospiežot kontroles (references) taustiņu “R”). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 1. etaps - reakcijas “kalibrēšana” Pēc iegūtajiem rezultātiem uz milimetru papīra konstruē graduācijas grafiku. - uz X ass atliek proteīnu masu (g), kura ar 20 l BSA šķīduma tika ienesta reakcijā. - uz Y ass atliek vidējo nomērīto optisko blīvumu (o.v.). Vienības uz asīm izvēlieties tā, lai racionāli tiktu izmantots viss milimetru papīra laukums! LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 1. etaps - reakcijas “kalibrēšana” . D (o.v.) . . . Grafikam jāsanāk lineāram! g BSA / 20 l šķīduma LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2. etaps - proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem. Veic reakcijas un mērījumus ar pārtikas produkta lizātu. (2 atkārtojumus) Rezultātus ieraksta 3. tabulā un aprēķina vidējo vērtību. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. . D (o.v.) . . . g BSA / 20 l šķīduma Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2. etaps - proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 3. etaps - produktu proteīnu satura aprēķini. No grafika nolasītos rezultātus ieraksta 3. un 4. tabulā. 4. tabulā apkopo arī grupas biedru rezultātus (proteīnu g / 20 l šķīduma). Veic aprēķinus un izsaka: - proteīnu daudzumu (g) 100 g svaiga produkta; - % no sausnas masas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. Uz nākošo nodarbību (mājas darbs) ! 5. uzdevums, 6. uzdevums. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML