Métodos de calibración: regresión y correlación

1. Estadística en el laboratorio Métodos de calibración:regresión y correlación

2. Objetivo • Calibración: • Necesidad dado el creciente uso de métodos analíticos, en lugar de los métodos tradicionales. • Ejemplo: electrodos pH, conductividad, etc. • Métodos automatizados para el procesamiento de gran cantidad de muestras. • Todos sujetos a potenciales errores sistemáticos que deben ser corregidos a tiempo.

3. Gráficos de calibración • Metodología: • Se procede a la medición de un analito en tres o más estándares en las mismas condiciones en las que será evaluada la muestra a analizar. • Se incluye la medición de un blanco (ausencia total del analito de interés). • Siempre se grafica la señal del analito en el eje y, y la concentración del analito en el eje x (consideración de errores en la medición del analito y no en la concentración del estándar). • Una vez que el gráfico de calibración ha sido obtenido, el analito puede ser luego evaluado por interpolación.

4. Gráficos de calibración • Sin embargo: • ¿El gráfico de calibración muestra una relación lineal? • Si es curva, ¿Cuál es la forma de la curva? • Si consideramos que cada medición realizada con los estándares es propensa a errores, ¿Cuál es la mejor línea (o curva) que expresa la relación entre el analito y la señal? • Asumiendo que la relación es lineal, ¿Cuáles son los errores y los límites de confianza de la pendiente y el intercepto? • Cuando el gráfico es utilizado para interpolar un valor, ¿Cuál es el error y los límites de confianza para el valor obtenido? • ¿Cual es la menor concentración del analito que puede ser detectado con un determinado nivel de confianza? (límite de detección)

5. Gráficos de calibración • Asunciones importantes: • Al realizar varias mediciones en un estándar, las mediciones resultantes presentan errores que son distribuidos normalmente. • La magnitud del error en y es independiente de la cantidad de analito en la muestra.

6. Gráficos de calibración • Relación lineal: • Responde a la ecuación: • y= mx+b • Donde: • y = valor de la señal del analito • m= pendiente de la recta (sensibilidad) • x= concentración del analito • b= intercepto (blanco)

7. Coeficiente de correlación • Identificando una relación lineal: • Coeficiente de correlación momento-producto (r), que nos permite evaluar si la relación existente entre las dos variables es lineal. • No subestimar el poder de un análisis gráfico.

8. Gráficos de calibración • Interpretando el valor de r:

9. Gráficos de calibración • Ejemplo: • Una solución acuosa estándar es examinada mediante espectrometría de fluorescencia. Los siguientes valores son obtenidos: • Determine el coeficiente de correlación (r)

10. Gráficos de calibración

11. Gráficos de calibración

12. Gráficos de calibración • Considere: • El valor de r podría ser cercano a uno, y sin embargo la relación entre las variables podría no ser lineal. • Un r de 0 únicamente nos indica que la relación no se ajusta a un modelo lineal, sin embargo pudiera existir otro modelo de relación.

13. Gráficos de calibración • ¿Como saber si la relación lineal es significativa? • Uso del estadístico t: • Donde: • Ho= no hay correlación lineal • Uso de la tabla t para dos colas y (n-2) grados de libertad.

14. La línea de la regresión • Mejor relación • Si tenemos evidencia de una relación lineal significativa, la siguiente pregunta es cuales son las características (pendiente e intercepto) de esa línea que se ajusta de la mejor manera a todos los datos. • Estrategia: • Esa línea es estimada mediante la reducción de los errores entre los valores medidos y los predichos por la función lineal (línea de regresión): • Minimización de la suma de los cuadrados de los residuos.

15. La línea de la regresión • Puede ser demostrado que la mejor “línea” que minimiza los errores esta dada por:

16. La línea de la regresión • Ejercicio: • Calcule la pendiente y el intercepto de la línea de regresión en base a los datos del ejemplo previo.

17. Errores en la pendiente y el intercepto

18. Errores en la pendiente y el intercepto • Las lecturas realizadas presentan un cierto error en la dirección y, que puede ser estimado por el estadístico sy/x para errores aleatorios en y:

19. Errores en la pendiente y el intercepto • Errores aleatorios en la pendiente (Sb) y el intercepto (Sa):

20. Errores en la pendiente y el intercepto • Donde se puede estimar los limites de confianza para: • Pendiente • b  t(n-2)Sb • Intercepto: • a  t(n-2)Sa

21. Errores en la pendiente y el intercepto • Ejercicio: • Calcule las desviaciones estándar y los límites de confianza de la pendiente y el intercepto de la línea de regresión elaborada anteriormente.

22. Calculo de una concentración y su error aleatorio • Una vez obtenida la ecuación de la curva, es fácil interpolar la concentración del analito (y) en base a la intensidad de la señal (x). • Debido a que tanto la pendiente, como el intercepto están sujetos a errores, es necesario también estimar el error asociado a la medición. • Dichos error total (aleatorio y sistemático) es de difícil determinación.

23. Calculo de una concentración y su error aleatorio • Simplificando: • Donde • yo es el valor experimental de y a partir del cual se determinó xo. • Sxo es la desviación estándar estimada de xo.

24. Calculo de una concentración y su error aleatorio • En ocasiones, se puede recurrir a realizar m lecturas para obtener el valor de yo, obteniéndose que sxo sería calculada: • Donde m es el número de lecturas realizadas para cada medición.

25. Calculo de una concentración y su error aleatorio • Límites de confianza: • Los límites de confianza para la medición realizada se calcularán mediante: • xo t(n-2)sxo • (con n-2 grados de libertad).

26. Calculo de una concentración y su error aleatorio • Ejercicio: • Empleando los datos del ejemplo anterior, determine los valores de xo, sxo, y los límites de confianza de xo para soluciones con intensidades de fluorescencia de 2.9; 13.5 y 23.0 unidades.

27. Calculo de una concentración y su error aleatorio • Observe que: • Los límites de confianza son menores cuando yo se aproxima al valor promedio de y. • Por tal motivo, la mayor precisión en las mediciones se obtendrán para lecturas que estén cerca al centro de la curva de calibración.

28. Calculo de una concentración y su error aleatorio • Como mejorar: • Aumentando el número de puntos de calibración (n). • Realizando más mediciones (m) para la determinación de yo. • Considere que demasiadas mediciones podrían no mejorar significativamente la precisión. • Considere que un incremento de n acarrea más estándares que preparar, mientras que un número pequeño de n significa mayores valores de t. • Se recomienda 6 puntos de calibrado y varias mediciones de yo. • Si existen restricciones para m y n, entonces la mejor opción (en base a la ecuación anterior) es que m=n.

29. Calculo de una concentración y su error aleatorio Sy/x Sa(intercepto) Sb(pendiente) Intercepto Pendiente

30. Límites de detección • Definición: • Aquella concentración que proporciona una señal en el instrumento (y) significativamente diferente de la señal del “blanco” o “ruido” de fondo. • Si bien es cierto no existe un consenso en cuanto a cuando es “significativamente diferente”, se suele generalizar que: • Límite de detección (LOD) = ŷblanco + 3sblanco • Donde para una calibración univariadasblanco= sy/x

31. Límites de detección

32. Límites de detección • Ejercicio: • Estime el límite de detección del ejemplo anterior.

33. Datos anómalos en la regresión • Estrategia: • Identificados mediante el análisis de los residuales (yi-ŷi). • Sin embargo, los residuales no son independientes pues su suma siempre será igual a cero. • Por tal razón un test Q no es aplicable. • Necesidad de recurrir a métodos gráficos

34. Datos anómalos en la regresión

35. Regresión para comparación de métodos analíticos • Justificación: • Cuando comparamos dos métodos para la determinación de un analito a varias concentraciones, podemos hacer uso de las técnicas estadísticas anteriores. • Sin embargo, cuando dicha evaluación se lleva a cabo en un amplio espectro de concentraciones, se debe recurrir a una regresión. • Logrando identificar presencia de errores sistemáticos.

36. Regresión para comparación de métodos analíticos • Ideal: • Pendiente = 1 • r = 1 • Intercepto = 0 • Sin embargo, imposible debido a errores aleatorios.

37. Regresión para comparación de métodos analíticos • Estrategia: • Contrastar que el origen de la recta difiere significativamente de cero. • Contrastar que la pendiente difiere significativamente de uno. • Haciendo uso de mediciones únicas o promediadas realizadas por ambos métodos.

38. Regresión para comparación de métodos analíticos • Ejercicio: