EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO EM SISTEMAS POLIMÉRIDOS DE DUAS FASES AQUOSAS

1. EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO EM SISTEMAS POLIMÉRIDOS DE DUAS FASES AQUOSAS - SPDFA -

2. Extração Líquido-Líquido Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os entre fases líquidas parcialmente solúveis ou insolúveis.

3. ELLBio Bioprodutos Intracelulares Acabamento Bioprodutos Extracelulares BIOPRODUTO PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS Rompimento Celular Purificação Separação de Células Clarificação

4. EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE BIOMOLÉCULAS ELLBio • Rápidos • Baixo custo • Biocompatíveis Vantagens comuns aos 3 métodos Sistemas Poliméricos (PEG) de Duas Fases Aquosas (SPDFA) Sistemas Micelares Reversos (SMR) Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA)

5. Processo de separação de fases Fase Líquida I (superior)        Sistema de duas fases Meio inicial: solução e/ou suspensão A FI AFII Fase Líquida Inicial                                                   K =       Fase Líquida II (inferior) Ae(fase ext) Ae(inicial) FP = AFI Ainicial . 100 R(%) = - massa transferência de massa

6. Fundamentos separação – em função da diferença de solubilidade da biomolécula nas fases Tipos de Sistemas Poliméricos • Dois polímeros não-iônicos: • PEG x Dextrana • PEG x Polivinil álcool • PPG x Dextrana • Metil Celulose x Hidroxipropil dextrana • 2) Polieletrólito x Polímero não-iônico • Sulfato dextrana de sódio x polipropileno-glicol • Carboximetilcelulose de sódio x metil celulose

7. 3) Dois polieletrólitos Sulfato dextrana de sódio x carboximetildextrana de sódio Carboximetildextrana de sódio x carboximetilcelulose de sódio 4) Polímero não-iônico x Composto de baixa massa molar PPG x fosfato de potássio PEG x fosfato de potássio metoxipolietileno glicol x fosfato de potássio PPG x glicose PEG x glicose PEG x sulfato de magnésio PEG x citrato de sódio

8. PEG x Dextrana PPG x Dextrana Sistemas mais estudados PEG x fosfato de potássio PEG x sulfato de magnésio PEG x citrato de sódio Fase de fundo Sistemas PEG x SAL • Rápida separação de fases • Baixo custo • Elevada seletividade na separação baseada na solubilidade

9. Curvas de Equilíbrio • Diagrama de fases: • ordenada: composição da molécula de maior concentração na fase de • TOPO (PEG, por exemplo) • abscissa: composição da molécula de maior concentração na fase de • FUNDO (Fosfato, por exemplo) • ambos os componentes do sistema estão presentes nas duas fases • o diagrama pode ser construído, determinando-se a composição das fases • em equilíbrio de uma série de sistemas • pontos acima da curva binodal: formação de duas fases • pontos abaixo da curva binodal: única fase Formação do SPDFA depende da concentração dos componentes do sistema

10. Composição da fase Topo T PEG (%massa) Composição inicial M Linha de amarração ou “tie line” Curva binodal C B Composição da fase de Fundo Ponto crítico Fosfato (%massa) Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato

11. Linha de amarração • sistemas cuja composição inicial encontra-se sobre uma mesma linha de amarração possuem a mesma composição final • As relação de volumes entre as fases varia com a composição - • de acordo com a razão entre os segmentos TM e BM • Segmento TM – proporcional ao volume da fase de FUNDO • Segmento BM – proporcional ao volume da fase de TOPO • C - Ponto crítico – composições e volumes da fase TOPO e FUNDO são iguais. Sistema instável.

13. VOLUMES DAS FASES EM FUNÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DOS COMPONENTES DO SISTEMA DE EXTRAÇÃO POR SPDFA

14. Curvas binodiais de sistemas com PEG 600 em diversos valores de pH A variação do pH altera a razão H2PO4-/HPO4-2  varia a composição o equilíbrio entre as fases Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos valores de pH

15. Curvas binodiais de sistemas com massas molares 600, 1500, 4000 e 6000 em pH 8,0

16. PEG fórmula geral: HO-(CH2CH2)n-CH2CH2OH. Massas molares: Abaixo de 1000 Daltons: líquido Acima de 1000 Daltons: sólido (pó, flocos) Prática: Soluções-Estoque 50% m/m Não se trabalha com volume devido à alta viscosidade

17. FATORES QUE INFLUENCIAM NO • COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (K) • DE BIOMOLÉCULAS • Interações Hidrofóbicas • Cargas superficiais / pH • Diferença de Potencial Elétrico entre as Fases • Efeito de “Salting-Out” da fase salina • Diferenças de Viscosidade • Diferenças de Densidade • Interações Bioespecíficas • Diagramas de Fases (conc. PEG e sal, p. ex.) • Massa molar da biomolécula

18. Fatores Ambientais • 1 Concentração de Polímeros • 2 Tipo e Concentração de Sal • 3 Ligantes • 4 Massa Molar do PEG • 5 pH • 6 Temperatura • 7 Tempo de Mistura e Separação • Fatores Estruturais • 1 Resíduos hidrofóbicos • 2 Massa molar da Biomolécula • 3 Formato da biomolécula

21. Coeficiente de Partição CTi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de topo CFi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de fundo.

22. Rendimento de Extração Rtopo = rendimento na fase de topo (%) Ctopo = concentração ou atividade da biomolécula na fase de topo (g/L ou U/mL) Cinicial = concentração ou atividade da biomolécula na amostra antes da extração (g/L ou U/mL)

23. Seletividade (S)

24. Balanço de Massa ou de Atividade (BM)

25. PEG/Potassium Phosphate PEG/Sodium Citrate células na interface células no fundo Clarificação simultânea à purificação Extração de retamicina (fase de topo) de meio contendo células de Streptomyces olindensis (fase de fundo) em SPDFA formados por PEG/citrato e PEG/fosfato: (1) PEG 400, (2) PEG 1500 e (3) PEG 6000).

26. Extrações baseadas em afinidade • Têm como base a capacidade que as biomoléculas têm de reconhecer e se ligar a outras moléculas, especificamente • Interações por afinidade: aumentam a partição - K  Kaf • O ligante é ligado covalentemente ao polímero – PEG em geral - •  formação do complexo polímero-ligante-biomolécula • O PEG reage facilmente com ligantes, pois contém hidroxilas substituíveis • O ligante pode ser natural ou sintético

27. Escolha do ligante • custo x benefício deve ser favorável • o ligante deve ser bifuncional – um sítio de ligação para afinidade com a biomolécula e outro sítio para imobilização no polímero • deve ser estável durante a imobilização • deve ser estável durante o processo de extração • não deve conter outros grupos que tenham afinidade por outras partes da biomolécula • não deve ser tóxico • disponível • fácil rompimento da interação polímero/biomolécula.

28. Exemplos de material purificado por partição de afinidade

29. Sistema de afinidade: fase superior rica em PEG-ligante e a molécula alvo a ser purificada e fase inferior rica em sal (sulfato de sódio) e contaminantes.

30. Processo de reciclagem do polímero

31. Proteínas purificadas por partição de metal-afinidade em SDFA

32. Biomoléculas nucleotídeo-dependentes purificadas em SDFA com afinidade a corantes.

34. Equipamentos para extração com sistemas de duas fases aquosas Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas funções: 1. Estabelecer o contato entre as duas fases líquidas do sistema para possibilitar a transferência de massa 2. Separar os dois líquidos após a extração

35. Equipamento por estágios • Misturador – decantador* • Misturador – decantador em cascata vertical Equipamentos de contato diferencial • Coluna de extração por estágios • Coluna de extração spray* • Coluna de extração com recheio • Extrator de discos rotativos perfurados • Extrator Graesser

38. Equipamentos centrífugos Mais importante: extrator Podbielniak Tambor cilíndrico com placas concêntricas Fase pesada é alimentada no centro do tambor enquanto a fase leve é alimentada na periferia do extrator Escoamento contra-corrente