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F. Dal Piaz, A. Zattoni, D. Parisi, M. Guardigli, P. Reschiglian, A. Roda

Accoppiamento della tecnica di frazionamento in campo flusso-flusso a fibra micro-tubulare porosa con spettrometria di massa electrospray per la caratterizzazione di proteine. F. Dal Piaz, A. Zattoni, D. Parisi, M. Guardigli, P. Reschiglian, A. Roda (Università di Bologna).

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F. Dal Piaz, A. Zattoni, D. Parisi, M. Guardigli, P. Reschiglian, A. Roda

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Presentation Transcript

  1. Accoppiamento della tecnica di frazionamento in campo flusso-flusso a fibra micro-tubulare porosa con spettrometria di massa electrospray per la caratterizzazione di proteine F. Dal Piaz, A. Zattoni, D. Parisi, M. Guardigli, P. Reschiglian, A. Roda (Università di Bologna)

  2. Relazione Struttura/Funzione nelle molecole proteiche

  3. Condizioni Denaturanti Condizioni Pseudo-Native ES/MS e conformazione proteica A.E. Ashcroft et al (2002) J Biol Chem. 277(36):33115-26

  4. ES/MS e complessi proteici M. Fändrich,et al, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97(26):14151-5.

  5. Sistemi separativi classici e analisi on-line di proteine e complessi proteici in condizioni native • RP-HPLC: Altamente denaturante • Gel Filtration: Difficoltà di interfacciamento • Elettroforesi Capillare: Blandamente denaturante • Difficoltà di interfacciamento Analytical Chemistry (2003) In press

  6. Introduzione del campione Campo esterno Principio della "Field-Flow Fractionation" Lunghezza Flusso Spessore Larghezza Detector Campione Spessore Flusso parabolico

  7. Il canale HF FlFFF Vrad Vin Vout 1/8” PE fitting 1/8” PE Tee 1/8” Teflon tube cPVC / PSfHF membrane 24x0.08 ID cm 1/8” PEEK ferrule 1/8” PEEK ferrule

  8. < > v Modo normale in HF FlFFFMeccanismo di ritenzione Browniano z Vrad L Vout rf Flusso x Vin U Campo

  9. Frazionamento di proteine in HF FlFFF Fase mobile: Ammonio acetato 50 mM ;pH7 Vin=0.70 ml/min ;Vrad=0.38 ml/min BSA 2% in FM ;mw 66 kDa Hrp 1% in FM ; mw40 kDa AP 1% in FM ; mw 160 kDa Fer 1% in FM ; mw 449 kDa

  10. Costruzione della retta di taratura lnD lnM vs V in t = — ln — R V 8D out r 2 kT f D=A M - b D= ph 3 d -11,0 Fer -10,5 AP Y = A + b * X BSA Hrp -10,0 Hb Parameter Value Error ln D Mio -9,5 A - 5.92967 0.30651 b - 0.37513 0.02702 -9,0 -8,5 9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 13,5 ln M

  11. 0.50 0.75 0.75 0.75 0.50 0.75 0.75 0.75 Pompa 1 Valvola d’iniezione 2 2 1 1 Pompa 2 3 3 0 0 HF FlFFF-ES/Q-TOF MS Valvola a 4 vie Valvola a spillo Manometro Valvola a T Scarico Fase mobile Manometro UV-DAD Fibra Valvola a spillo Fase mobile Scarico ES/Q-TOF Valvola di splitting

  12. UV/vis DAD Valvola di splitting Canale HF FlFFF Sorgente ES

  13. +50 +45 +55 +40 +36 +60 66397.8 Peso Molecolare misurato:66397.81±1.74 Da Peso Molecolare teorico: 66398.61 Da Analisi HF-FlFFF-MS della BSA Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7

  14. F 43244.1 D 42422.0 E 43165.0 C 42343.1 B 41600.4 A 41521.5 Analisi HF-FlFFF-MS della HRP 80 70 60 50 40 segnaleUV@280 nm(mAU) 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 1800 1600 1400 1200 1000 TIC 800 600 400 200 0 0 2 4 6 tempo (min) Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7

  15. F 43244.1 E 43165.0 C 42343.1 D 42422.0 2 Ca 2+ 2 Ca 2+ 2 Ca 2+ Glicosilazione A 41521.5 B 41600.4 Glicosilazione

  16. Analisi HF-FlFFF-MS della mioglobina da cavallo +9 +8 +7 +6 17566.70 P. M. Mioglobina:16951.51 Da P. M. Eme:615.35 Da P. M. Misurato:17566.69±0.58 Da Fase mobile:ammonio acetato 50mM ;pH7

  17. A9 A8 A:17566.69±0.58 Da A7 A10 B11 B:16951.48±0.27 Da B10 B9 B8 B7 HF-FlFFF-MS LC-MS

  18. Confronto spettri ES/MS del complesso Mioglobina/Eme +9 +Na+ Introduzione Diretta +2Na+ +3Na+ +9 HF-FlFFF +CH3COO-

  19. Analisi HF-FlFFF-MS dell’emoglobina umana B 15740.6 P.M. teorico Hb-: 15126.23 Da P.M. teorico Hb-: 15867.19 Da Eme A 15125.9 Fase mobile: Ammonio Acetato50mM ;pH7

  20. Conclusioni L’accoppiamento HF-FIFFF/spettrometria di massa costituisce un sistema semplice e robusto per l’analisi di proteine e complessi proteici in condizioni native: 1) L’interfacciamento non presenta problemi rilevanti. 2) L’assenza di interazione con una fase stazionaria e la possibilità di utilizzare qualsiasi tipo di solvente garantiscono il mantenimento della stabilita’ delle proteine e dei complessi in esame. Prospettive a) Miniaturizzazione del sistema separativo per interfacciamento diretto con sorgente nanospray b) Valutazione dell’efficienza nell’analisi di miscele più o meno complesse c) Possibilità di utilizzo dell’HF-FlFFF all’interno di un sistema cromatografico multidimensionale accoppiato con uno spettrometro di massa, per sudi nel campo della proteomica.

  21. Ringraziamenti

  22. å = + + + + H H H H H H neq long poly inj i Focalizzazione L0 Eluizione Efficenza in HF FlFFF van Bruijnsvoort, M.; Kok, W.Th; Tijssen, R. Anal Chem 2001, 73, 4736

  23. Spettro ES/MS del lisozima separato in FFF dalla BSA +8 Peso Molecolare misurato:14305.06±1.05 Da +7 +9 14305.1

  24. Spettro ES/MS della BSA separata in FFF dal lisozima Liso+8 Liso+7 +35 +40 +30 +43 +27 66399.53 Peso Molecolare misurato:66399.53±4.38 Da

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