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第三章 体外分析技术 in vitro radioligand binding assay

第三章 体外分析技术 in vitro radioligand binding assay. 吉大二院 赵银龙. 主要内容. 1 、掌握放射免疫分析的基本概念及原理。 2 、了解免疫放射分析的基本原理。 3 、掌握放射免疫及免疫放射分析的区别。 4 、掌握质量控制。 5 、了解非放射性免疫分析技术。 6 、掌握体外分析的临床应用。. -12. -6. -3. -0. -9. 10. 10. 10. 10. 10. 待测物质浓度与检测手段. 超微量. 微量. 常量. 临床化学分析. g/L. m g/mL. pg/mL. ng/mL.

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第三章 体外分析技术 in vitro radioligand binding assay

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  1. 第三章 体外分析技术in vitro radioligand binding assay 吉大二院 赵银龙

  2. 主要内容 1、掌握放射免疫分析的基本概念及原理。 2、了解免疫放射分析的基本原理。 3、掌握放射免疫及免疫放射分析的区别。 4、掌握质量控制。 5、了解非放射性免疫分析技术。 6、掌握体外分析的临床应用。

  3. -12 -6 -3 -0 -9 10 10 10 10 10 待测物质浓度与检测手段 超微量 微量 常量 临床化学分析 g/L mg/mL pg/mL ng/mL mg/mL 免疫分析 Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins

  4. 现代医学的发展疾病诊断的革新 可在没有任何临床症状，而病人体内发生 1. 基因表达异常； 2. 受体分布异常或受体功能改变； 3. 器官代谢异常； 4. 激素水平异常 酶、神经递质 ……等异常， 可早期发现。 体外分析和影像学的发展起了很大作用 例如 癌症的早期诊断

  5. 放射性竞争结合分析 放射免疫分析 (RIA) 体外放射分析 体外分析技术 放射性非竞争结合分析 免疫放射分析 (IRMA) 酶免疫分析 (EIA) 化学发光免疫分析 体外非放射分析 (CLIA) 荧光免疫分析 (FIA)

  6. 什么是体外放射分析技术呢？ 体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和高特异性结合反应的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。

  7. 第一节 放射免疫分析

  8. 放射免疫分析法 (radioimmunoassay) 一、概念 在体外条件下, 利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术。 Dr. Yalow

  9. 放射免疫分析法的创立集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫反应的高特异性放射免疫分析法的创立集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫反应的高特异性 • 1959 美国Yalow & Berson • 1960 英国 Ekim’s • 1977 获诺贝尔医学生物学奖 开创了医学生物学超微量分析方法 使人体内微量生物活性物质的测量成为可能 对现代医学的发展起到推动作用

  10. 放射免疫分析法不仅保留了免疫反应的高度特异性，而且又引入了放射性测定的高度灵敏性，可以检测出10-9~10-18的微量物质。因此也是我们重点讲述和要求大家重点掌握的内容。放射免疫分析法不仅保留了免疫反应的高度特异性，而且又引入了放射性测定的高度灵敏性，可以检测出10-9~10-18的微量物质。因此也是我们重点讲述和要求大家重点掌握的内容。

  11. 二、基本原理 • *Ag与Ag免疫活性相同 • *Ag＋Ag > Ab *Ag-Ab +*Ag *Ag Ab + (F) (B) + Ag-Ab + Ag Ag Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)

  12. *Ag Ag *AgAb AgAb *Ag Ab + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

  13. 标准曲线的制备 制备标准曲线，需要标准品，即需要标准抗原，是样品定量的基础，它的质和量的变化会直接影响到测量的结果。对标准品要求如下：1、应与被测物属同一物质。 2、放射化学纯度高，影响分析的杂质少。 3、定量精确。

  14. B3% B4% B1% B2% B5% B6% 标准曲线的制备 Ab 分离B、F *Ag B%=B/(B+F) F%=F/(B+F) R=B/F Ag 1 2 3 4 5 6 50 100 25 200 800 400 浓度

  15. B% 标 准 曲 线

  16. 60

  17. 三、基本方法 基本试剂 1.抗体 2.标记抗原 3.非标记标准抗原（标准品）

  18. 四、操作基本步骤 • 加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。 • 孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。 • 分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原－抗体复合物。 • 测量：测量游离或结合物部分的放射性。 • 数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。

  19. 五、分离方法的要求 分离的目的：放射免疫反应达到平衡后，使抗原抗体复合物和游离抗原分离，两者分离后才能分别测定其放射性，选择合适的分离技术，将直接影响结果的准确性。理想的分离技术如下： 1、分离完全、快速。 2、不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 3、受环境因素（温度、pH值等）的影响小。 4、操作简便，分离剂来源丰富、价廉。

  20. 六、质量控制（quality control） (一)实验室内部质量控制 从采集血样到报告发出全过程的监测。 质控图-连续测定10批以上已知浓度的质控血清，分别求出质控样品均数±标准差，绘制得出。 （二）试剂盒的质量控制※ （三）实验室外的质量控制 各个实验室之间的测定结果有一个统一的评价标准。

  21. 试剂盒的质量控制 1）精密度（precision）-同一样品重复测定的实测浓度的离散程度，即同一浓度样品重复管的重复性，用变异系数（ CV ）7%~10%。 2）准确度-样品测定值和真值相差的程度。常用回收率=测定值/真实值×100% 90%~110% 3）灵敏度-就是RIA能测定的用统计学方法可以与零剂量相区别的最小量。又称方法的最小可测量。 4）特异性-方法的特异性主要取决于抗体的特异性。 用抗体的交叉反应率来表示。 5）稳定性-反映RIA实验批间的重复性。常用B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 表示。 6）健全性-又称可靠性，是评价标准品与被测物免疫活性是否相同。 体外分析室常选用准确度-质控血清。临床中简便有效的方法，出厂时发于试剂盒中。可测定高、中、低剂量的质控样品。

  22. 质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。 具体作用有： 1．检查误差的程度，决定测定结果的取舍。 2．识别误差的来源并消除其原因。 3．改进测定方法的设计以提高质量。

  23. RIA小结 • 灵敏度高 • 特异性好 • 精确的定量 • 方法操作简便

  24. 第二节 免疫放射分析法 （immunoradiometric assay,IRMA） Ag B% + *Ab Ag-*Ab + *Ab （F） （B） 在体外, 利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。

  25. 基本原理 • 免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体反应，是用过量的放射性标记抗体来测定样品中的抗原，其中标记抗体是过量的，抗原全部是非标记的。 将放射性核素标记在抗体上，用过量的抗体与抗原结合，反应平衡后，用分离方法除去多余的抗体，测量抗原-标记抗体复合物的放射性。利用抗原-标记抗体复合物的放射性活度与抗原剂量之间的函数关系来测定待测抗原的量。

  26. 代表方法（夹心法） 将分离抗体涂在反应容器的壁上，称固相抗体。固相抗体先于抗原反应，形成固相抗体－抗原复合物，再与标记抗体反应，形成固相抗体－抗原－标记抗体复合物附着在管壁上，倾去上清液直接测量反应容器的放射性。

  27. IRMA与RIA工作原理的主要区别

  28. B% 拟合的标准曲线 IRMA的标准曲线及非特异结合曲线 拟合的NSB B% 拟合的标准曲线 RIA的标准曲线及非特异结合曲线 拟合的NSB

  29. 第三节非放射性标记免疫分析技术 酶标记免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术

  30. 酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。

  31. ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。 常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺(TMB) ，反应后显黄色。

  32. 化学发光免疫分析技术 • 化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 • 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。

  33. 1.化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。

  34. 2.化学发光酶免疫分析 和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物--金刚烷，使底物发射出光子。 此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。

  35. 时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay） 时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。

  36. 第四节 体外分析的临床应用 （一）甲状腺相关检测 甲状腺是人体较大的内分泌腺器官，其主要功能是合成、储存和分泌甲状腺激素（thyroid hormone）。甲状腺滤泡（thyroid follicles）是甲状腺结构和功能的基本单位。滤泡上皮细胞合成和分泌甲状腺激素，并以与甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）的形式储存于滤泡腔内。贮存的甲状腺激素可供机体利用长达50～120天之久。

  37. TT3 结合态(BT3) 99.7% 游离态(FT3) 0.3% 游离态(FT4) 0.03% TT4 结合态(BT4) 99.97% 发挥生物效应的部分，能真正反映甲功情况 与TBG（主要）TBPA、ALb结合 一种无活性的甲状腺激素，95%由T4转化而来，仅5%由甲状腺分泌，对调节T3、T4的最佳浓度水平发挥作用 rT3

  38. (二)主要检测项目及临床意义 1. 甲状腺激素的测定 正常值范围 TT4 42～135nmol/L TT3 0.8～2.2nmol/L FT4 11.5～23.2pmol/L FT3 3.5～6.5pmol/L rT3 0.5～1.2nmol/L

  39. 临 床 意 义 1）甲状腺功能亢进症的诊断 3) 指导甲亢患者的药物治疗 2）甲状腺功能减退症的诊断 甲亢：TT3↑、TT4↑、FT3↑、FT4↑、rT3↑ 甲减：TT3↓、TT4 ↓、FT3↓、FT4↓、rT3↓ 特殊情况TT3 、TT4变化可不一致 4) 指导甲减患者的药物治疗 5) 亚急性甲状腺炎的辅助诊断

  40. 2. 促甲状腺激素的测定 临床意义: 1）甲减的诊断和鉴别诊断 2）甲亢的诊断 3）指导甲亢和甲减患者的药物治疗 4）先天性甲减的筛查 5）异位TSH分泌

  41. 3. 甲状腺球蛋白的测定 临床意义: 1）分化型甲状腺癌术后的监测 2）甲状腺炎的辅助诊断

  42. 4. 抗甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、抗甲状腺微粒体抗体（TMAb）的测定 正常值 临床意义 1）慢性淋巴细胞性甲状腺炎的诊断 2）部分Graves病患者也会表现抗体水平升高，甲亢病情控制后，水平会随之下降。抗体升高的Graves病患者行手术或131I治疗后发生甲减的可能性较大。

  43. 5. 促甲状腺激素受体抗体（TSH receptor antibodies，TRAb）的测定 临床意义: 1）GD的诊断、疗效评价及停药判定 2）甲亢病因的鉴别 3）新生儿甲亢的诊断和预测 4）作为甲状腺功能正常的Graves眼病的辅助诊断

  44. （二）肿瘤检测类： 1、AFP：原发性肝细胞癌。 2、 CA-125：卵巢癌。 3、CA-153：乳腺癌。 4、CA-199：胰腺癌。 5、PSA：前列腺癌。 6、CA-50：恶性肿瘤的诊断和疗效观察。 7、CA-242：胰腺癌，肝癌。 8、NSE：小细胞未分化癌，神经内分泌肿瘤。 9、Ferritin：缺铁性贫血，白血病，恶性淋巴瘤，多发骨髓瘤。 10、CEA: 消化道恶性肿瘤。 11、β2-MG：多发骨髓瘤，肝癌，胃癌，结肠癌，白血病，肾炎肾衰。

  45. 三、性腺类： T、E2、E3、P、HCG、hGH、FSH、LH、PRL 四、糖尿病类： Insulin、 C-肽、 Anti-Ins、谷氨酸脱羧酶抗体，酪氨酸脱羧酶抗体 五、心血管、肾病类： A I、A II、β2-MG、α1-MG、皮质醇、醛固酮、心钠素、ACTH、血栓素B2 六、胃肠病、骨代谢及其他： 胃泌素、降钙素、骨钙素、PTH、Anti-DNA、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、IL-2、IL-6、IL-8。

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