1 / 16

Immuno precipitatie

Variabele deel bindt specifiek aan antigeen (Fab domein). Constante gedeelte (Fc domein). Immuno precipitatie. Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt Wat is een antilichaam? Eiwit dat in een dier wordt geproduceerd als reactie op antigeen (een lichaamsvreemde stof, bv. een eiwit).

teenie
Download Presentation

Immuno precipitatie

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Variabele deel bindt specifiek aan antigeen (Fab domein) Constante gedeelte (Fc domein) Immunoprecipitatie • Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt • Wat is een antilichaam? Eiwit dat in een dier wordt geproduceerd als reactie op antigeen (een lichaamsvreemde stof, bv. een eiwit)

  2. Hoe wordt een antilichaam gemaakt? • Dier (konijn, muis, kip) produceert antilichamen als reactie op inbrengen antigeen • Antilichaam materiaal verzamelen (bloed, eieren) • - bevat antilichamen tegen veel verschillende antigenen!!! • Zuiveren antilichamen uit dit materiaal (slechts een bepaald percentage van de antilichamen bindt aan specifiek antigeen)

  3. Eiwit 2 anti-GFP Immunoprecipitatie • Techniek om eiwitcomplexen te identificeren - hierdoor wordt duidelijker welke functie deze eiwitten hebben GFP Eiwit 1 Eiwit 3 • Een antilichaam herkent een van de eiwitten - vaak wordt een fusie eiwit gemaakt, bijv. met GFP

  4. Voorbeeld immunoprecipitatie (uit onderzoeksgroep van Dolf Weijers) Eiwit 2 Eiwit 1 wild-type wortel wortel zonder eiwit 1 (mutant) wortel zonder eiwit 2 (mutant) GFP Lokalisatie eiwit1-GFP in vaatweefsel plantenwortel abnormaal vaatweefsel Eiwitcomplex geeft informatie over de functie van het eiwit

  5. Hoe voer je een immunoprecipitatie uit? • weefsel met eiwit-GFP malen • anti-GFP toevoegen aan cel extract Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 GFP GFP GFP GFP GFP GFP GFP GFP

  6. Binden aan Protein A agarose Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 2 Protein A Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 Eiwit 1 agarose bolletje agarose bolletje GFP GFP GFP GFP GFP GFP GFP

  7. Precipitatie eiwitcomplex door centrifugeren vloeistof afpipetteren bolletjes wassen

  8. Hoe voer je een immunoprecipitatie uit? Eiwitcomplex denatureren en op gel laden Eiwitbandjes scheiden door electroforese, kleuren en uitsnijden SDS-polyacrylamide gelelectroforese

  9. Proteomics: identificatie van de eiwitten Voorbehandeling met iodoacetaat om de vrije SH groepen (cysteines) van de eiwitten te blokkeren door carboxymethylering

  10. Proteolyse Eiwit in stukjes knippen met trypsine tot korte peptides

  11. Voorbehandeling geëxtraheerde peptiden De geëxtraheerde peptiden worden ontzout en gemengd met matrix oplossing. Dit mengsel wordt op een plaatje gebracht en verdampt zodat er kristallen van het matrixmateriaal en peptiden overblijven. Na bestraling door een laser en ionisatie (MALDI) worden de peptiden geanalyseerd met TOF mass spectrometrie.

  12. MALDI-TOF spectrometer

  13. Identificatie van eiwitcomplex De massa van een polypeptide keten kan bepaald worden met de MALDI-TOF techniek. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight

  14. Massaspectrum tryptisch digest Massa en lading van elk peptide worden geregistreerd Identificatie van de eiwitten

  15. Voorwaarden voorsuccesvolleIP Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP Eiwit 2 Eiwit 2 Eiwit 1 Eiwit 1 GFP GFP

  16. Uitvoering experiment • Testen van kwaliteit antilichaampreparaat Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP • Immunoprecipitatie en isolatie peptides • Identificatie peptide(s) en • Toekenning eiwitcomplex

More Related