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R F L P. 限制性片段长度多态性. R F L P. Restriction Fragment Length Polymorphism. 是随着生物技术若干领域的发展而产生的一种分子标记技术. 一． 限制性内切酶（ restriction endonuclease ）. 1. 简 介. 限制性内切酶是一类具有特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特异的 DNA 序列，并将 DNA 切断. I 型 酶 :.

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Presentation Transcript

  1. R F L P 限制性片段长度多态性

  2. R F L P • Restriction Fragment Length Polymorphism

  3. 是随着生物技术若干领域的发展而产生的一种分子标记技术是随着生物技术若干领域的发展而产生的一种分子标记技术

  4. 一． 限制性内切酶（restriction endonuclease）

  5. 1. 简 介 • 限制性内切酶是一类具有特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特异的DNA序列，并将 DNA切断

  6. I 型 酶: • 如酶的识别位点上两条DNA链均未甲基化，就行使内切酶功能，但切割点不在识别位点，而在1kb（不少于400bp）或nkb(最多7kb)处随机切割；如一条DNA链是甲基化，就行使甲基化酶功能，使另一条链甲基化；如两条链均已甲基化，则酶与DNA链解离。

  7. III 型 酶 • 与I型酶特性类似，也有甲基化功能。不同的是它能在DNA链上的特异位点切割，其切割位点在识别位点以外，对基因工程的意义也不大。

  8. II 型 酶 • 就是通常指的DNA限制性内切酶，II型限制酶分子量小、仅需Mg2＋作为催化反应辅助因子。它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。

  9. II型限制性内切酶的最大特点是识别DNA特异顺序并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱等技术中广泛应用。II型限制性内切酶的最大特点是识别DNA特异顺序并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱等技术中广泛应用。

  10. 2. 性质和特点： • 分子大小 20－100kdal • 作用条件 对离子强度要求高 • 识别顺序 大多4－6bp 迴文结构 • 切口 就在识别顺序内

  11. 同工异源酶 （isoschizomer） • 不同来源分离出来，但具有相同识别顺序，切割DNA方式可以相同，也可以不同。

  12. Sma I Xma I • C C C G G G C C C G G G • G G G C C C G G G C C C

  13. 同尾酶（subset） • 不同的酶但切割后突起的核苷酸序列相同，可相互连接，重组后可能不被原先酶识别。

  14. BamH I: • GGATCC • CCTAGG • Bgl II:GGATCT • AGATCT CCTAGA • TCTAGA

  15. 远距离裂解酶（distant cleavage） • 识别位点与切割位点不一致，切割点在识别位点旁10bp左右，如Mb2 识别顺序GAAGA,切割位点在下游第8个bp。

  16. 可 变 酶 • 识别顺序中1个或几个核苷酸是可变的，识别顺序>6bp。 • 如Bgl I 识别GCC(N5)GGC, 其N5为5个可变碱基。

  17. 3. 内切酶活性定义： • 在适当反应条件下，1小时内完全酶解1g特定DNA底物所需要的限制性内切酶的量，为一个活性单位。

  18. 二、DNA限制性内切酶酶 • 切图谱

  19. 限制性内切酶图谱：也称DNA物理图谱，是DNA链上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为DNA片段的特殊标记。是DNA特征的证据。限制性内切酶图谱：也称DNA物理图谱，是DNA链上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为DNA片段的特殊标记。是DNA特征的证据。

  20. 识别4个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为:识别4个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为: • 1 / 44＝1 / 256bp

  21. 识别6个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为:识别6个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为: • 1 / 46 ＝ 1 / 4.1kb

  22. 识别8个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为:识别8个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为: • 1 / 48＝1 / 65.5kb

  23. DNA限制性内切酶酶切图谱的建立

  24. A、部分酶解法：

  25. ①完全酶解 3 ，2， 1 kb • ②部分酶解 6，5，4，3，2, 1 kb • ③分析 5=3+2 4=3+1 3在中间

  26. B.两种以上限制性内切酶交叉酶解法： • 总长 EcoRⅠ HpaⅡ • 3kb 1.7，0.9，0.4 1.6，1.4 • EcoRⅠ+ HpaⅡ • 1.2 , 0.9 , 0.5 , 0.4

  27. 总长 EcoRⅠ HpaⅡ3kb 1.7，0.9，0.4 1.6，1.4 EcoRⅠ+ HpaⅡ 1.2 , 0.9 , 0.5 , 0.4 • 分析： ①HpaⅡ一个切点，可肯定②EcoRⅠ1.7 kb不在末端，在中间③EcoRⅠ 0.9和0.4 kb都在末端 • ④逻辑判断以上二片段在哪一边末端

  28. C.同位素末端标记，部分酶解法

  29. 三、RFLP的检测

  30. 1、 RFLP产生的原因

  31. 在一个特定基因座位上，存在着两个或两个以上的等位基因，其中任何一个在人群中频率不低于10%，这就是多态性。在一个特定基因座位上，存在着两个或两个以上的等位基因，其中任何一个在人群中频率不低于10%，这就是多态性。

  32. 但现在认为不同个体中同一位点上DNA核苷酸序列产生变异，且在人群中发生频率大于1%，就可认为是多态性。但现在认为不同个体中同一位点上DNA核苷酸序列产生变异，且在人群中发生频率大于1%，就可认为是多态性。

  33. SNP（单核苷酸多态性），由单个核苷酸变异引起的DNA顺序的多态性，估计人类基因组中存在约几百万个，约每1000个bp左右就有一个。SNP（单核苷酸多态性），由单个核苷酸变异引起的DNA顺序的多态性，估计人类基因组中存在约几百万个，约每1000个bp左右就有一个。

  34. 如在限制性内切酶酶切位点发生核苷酸的变异（或多态性），就会产生RFLP，除SNP外，还包括缺失、重复、插入、基因重排以及串联重复序列拷贝数的变异。如在限制性内切酶酶切位点发生核苷酸的变异（或多态性），就会产生RFLP，除SNP外，还包括缺失、重复、插入、基因重排以及串联重复序列拷贝数的变异。

  35. 2. 检测方法

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