A „GYORS” BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG VIZSGÁLATA

1. A „GYORS” BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG VIZSGÁLATA OECD 301-F Manometrikus respirometria Készítette: Bocz Katalin (GAEOAV) Környezettoxikológia 2010.

2. Biodegradáció, biodegradálhatóság • Biodegradáció: egy szerves molekula komplexitásának csökkentését, vagy teljes lebontását, mineralizációját jelenti, melynek mértékét és sebességét a szerves vegyület biodegradálhatósága és a környezet biodegradáló képessége együttesen szabja meg. • Biodegradálhatóság: szerves vegyületek immanens anyagi tulajdonsága a kémiai szerkezetéből adódó biológiai bonthatósága. • biodegdadálhatósáuk alapján a vegyületek lehetnek könnyen-, nehezen biodegradálhatóak, valamint perzisztensek • egy szerves molekula biodegradálhatósága egyértelmű összefüggésbe hozható illékonyságával, vízoldhatóságával, polaritásával, illetve oktanol-víz megoszlási hányadosával (Kow). • egy szerves vegyület biodegradálhatóságát fizikai-kémai tulajdonságai egyértelműen meghatározzák • QSAR (a vegyi anyag szerkezetének és aktivitásának mennyiségi összefüggése) lehetővé teszi, hogy egy vegyi anyag biodegradálhatóságának mértékét kísérletek nélkül, pusztán a molekula szerkezete és ismert biodegradálhatóságú vegyületekkel való összehasonlítása alapján, modellezés segítségével jellemezzük. A vegyületek, szennyezőanyagok biodegradálhatósága egy adott rendszerben számos faktor függvénye: A molekula-szerkezettel összefüggő paraméterek: Illékonyság, vízoldhatóság, oktanol- víz megoszlási hányados. A rendszerrel összefüggő paraméterek: Tesztközeg, inokulum, pH, oxigén, hőmérséklet, expozíciós idő, szubsztrát-koncentráció.

3. OECD 301 OECD 301: Hat vizsgálati módszer vegyi anyagok vizsgálatára a biológiailag könnyen végbemenő lebonthatóság szempontjából, valamely aerob vizes közegben: a) Oldott szerves szén- („Dissolved Organic Carbon” = DOC) csökkenés b) Módosított OECD vizsgálat – DOC-csökkenés; c) Szén-dioxid-fejlődés-vizsgálat (CO2) (módosított Sturm-féle vizsgálat); d) Manometrikus respirometria; (OECD 301 F) e) Zárt palack; f) MITI (Ministry of International Trade and Industry – Japán). Egy 1988-ban, az OECD-országok laboratóriumaiban végrehajtott körvizsgálat azt mutatta, hogy a módszerek egymással egyező eredményeket adnak. Azonban a vizsgált anyag fizikai jellemzőitől függően a módszerek közül az egyik vagy a másik előnyben részesíthető. A továbbiakban az OECD 301 F szabványnak megfelelő, manometrikus respirometriás módszert ismertetem részletesebben.

4. A megfelelő módszer kiválasztása • A legmegfelelőbb módszer kiválasztásához szükséges információk a vegyi anyagról: • oldhatóság, • gőznyomás, • adszorpciós jellemzők, • kémiai szerkezet vagy képlet → ThOD, ThCO2, DOC, TOC, KOI elméleti értékeinek • kiszámítása és/vagy mért értékeinek ellenőrzése. (Th = theoretical) • Amennyiben a vizsgált anyag: • vízben legalább 100 mg/l mértékben oldható • nem illékony, • nem adszorbeálódik • Amennyiben a vizsgált anyag vízben gyengén oldható, illékony vagy adszorbeálódik, a táblázat tartalmazza a megfelelő módszert: Bármely OECD 301 módszerrel kiértékelhető Fontos: a vizsgált anyag baktériummal szembeni toxicitására vonatkozó információk ismerete az alacsony biológiai lebomlási értékek megfelelő értelmezéséhez (gátlás vagy közömbösség).

5. Referenciaanyagok • Az eljárás ellenőrzéséhez • A normál vizsgálatsorozattal egyidejűleg • Referenciaanyagok: kielégítik a biológiailag gyors lebonthatóság kritériumait • Pl.: anilin (frissen desztillált), • nátrium-acetát, • nátrium-benzoát. • E referenciaanyagok közül mindegyik lebomlik ezen módszerekben, még akkor is, ha szándékosan nem történt inokulum-hozzáadás. • Olyan referenciaanyag, mely biológiailag gyorsan lebontható, de amelyhez szükség van valamilyen inokulum hozzáadására: pl. kálium-hidrogén-ftalát • A respirometriás vizsgálatokban a nitrogéntartalmú vegyületek a nitrifikáció miatt hatással • lehetnek az oxigénfelvételre.

6. A „gyors” biodegradálhatósági vizsgálatok • A vizsgált anyagot ásványianyag-tápoldatbanfel kell oldani vagy szuszpendálni, • Aerob körülmények mellett, • sötétben vagy diffúz fényben be kell oltani és inkubálni, • a vizsgált oldatban az oltóanyagnak tulajdonítható DOC (oldott szerves szén) mennyiségét a vizsgált anyagnak tulajdonítható DOC-mennyiséggel összehasonlítva a lehető legkisebb értéken kell tartani • az inokulum endogén aktivitását figyelembe kell venni egyidejűleg végzett vakpróbák segítségével (az oldat csak inokulumot tartalmaz, de vizsgált anyagot nem) • egyidejűleg vizsgálni kell egy referenciaanyagot az eljárások működésének ellenőrzésére. • lebomlás után DOC, CO2-képződés és oxigénfelvétel meghatározása, • gyakori mérések a biológiai lebomlás kezdete és vége megállapítására (automata respirométer alkalmazása esetén a mérés folyamatos.) • A vizsgálat általában 28 napig tart • (A vizsgálat befejezhető a 28. nap előtt is, ha a biodegradációs görbe elért egy platót legalább három párhuzamos meghatározás során. A vizsgálatok 28 napon túlra is meghosszabbíthatók, amikor a biodegradációs görbe azt mutatja, hogy a biológiai lebomlás elkezdődött, de a plató (a vízszintes szakasz) elérése a 28. napig nem történt meg.)

7. Minőségi követelmények • Reprodukálhatóság: • a meghatározásokat legalábbkétszer kell végrehajtani (a biológiai lebomlás természete és az inokulumként használt baktériumpopulációk sokfélesége miatt) • minél nagyobb a vizsgált oldószerhez kezdetben hozzáadott mikroorganizmusokkoncentrációja, annál kisebb lesz az ismétlések közötti eltérés (szórás). • A vizsgálat érvényessége: • A vizsgálat akkor tekinthető érvényesnek, • ha a vizsgálat végén (vagy a „tíznapos ablak” végén), a platónál az ismétléssel kapott értékek szélső értékeinek különbsége kisebb mint 20 %, és • ha a referenciaanyag százalékos lebomlása 14 nap alatt elérte a könnyű biológiai lebonthatóság szintjét. • Ha ezek közül a feltételek közül valamelyik nem teljesül, meg kell ismételni a vizsgálatot. • Ha valamely toxicitási vizsgálatban, amely mind a vizsgált anyagot, mind a referenciaanyagot tartalmazza, 35 %-nál kisebb lebomlás (a DOC alapján) vagy 25 %-nál kisebb lebomlás (a ThOD vagy ThCO2 alapján) történt 14 nap alatt, a vizsgált kémiai anyagról feltételezhető, hogy annak gátló hatásai vannak.

8. A manometrikus oxigén-meghatározás A biodegradáció nyomon követésére direkt vagy indirekt módon mérik a szerves szénoxidációját (CO2 -termelés és az O2 -felvétel mérése). A manometrikus oxigén-meghatározás lényege, hogy az élő szervezetek az O2 elfogyasztása mellett, széndioxidot állítanak elő. Az utóbbi gázt megköti egy abszorpciós szer, és ennek eredményeként nem szabad gázként jelenik meg, amiből következően a nyomás megváltozása kizárólag az oxigénfogyasztásra vezethető vissza, amit manometrikusan mérünk. Feltételek: • A (biológiailag aktív) mintának gázt át nem eresztő edénybe zárva kell lennie. • A minta fölött levegővel töltött, megfelelően méretezett gáztérnek kell rendelkezésre állnia, amely korlátozás nélkül biztosítja a biológiai lebontáshoz szükséges oxigént. • A mérőedényben a széndioxid megkötésére szolgáló abszorpciós szert kell elhelyezni olyan módon, hogy az ne kerülhessen érintkezésbe a mintával. • A reakcióedényen megfelelő nyomásmérő berendezést kell elhelyezni. • A reakcióedényt a mérés közben állandó hőmérsékletű helyen kell tartani.

9. Az OECD 301-F vizsgálati módszer elve • Kizárólagos szerves szénforrásként a vizsgált anyag ismert koncentrációját (100 mg/l vizsgált anyag, legalább 50–100 mg ThOD/liter létrehozásához) tartalmazó, mért térfogatú, beoltott ásványianyag-tápoldatot kell keverni zárt lombikban, állandó hőmérsékleten (± 1 oC vagy ennél kisebb eltérés mellett) legfeljebb 28 napig. • 2. Meg kell határozni azoxigénfogyasztást vagy a respirométer-palackban az állandógáztérfogat fenntartásához szükséges (elektrolízis útján előállított) oxigénmennyiség mérésével, vagy a készülékbeli térfogat- vagy nyomásváltozás (vagy a kettő valamilyen kombinációjának) vizsgálatával. • A fejlődött szén-dioxidotkáliumhidroxid-oldatban vagy valamilyen más alkalmas abszorbensben nyeletik el. • 3. A vizsgált anyag által felvett oxigén (az egyidejűleg vizsgált vakpróba-inokulum által felvett mennyiség figyelembevételével helyesbítve) mennyiségét a ThOD vagy a KOIszázalékaként kell kifejezni.

10. A készülék a) Tesztlombikok b) Alkalmas respirométer (pl. OxiTop); c) Termosztát, amely ± 1 oC vagy ennél nagyobb pontossággal képes a hőmérséklet fenntartására; d) Membránszűrő készülék (választható); e) Szénanalizátor (választható).

11. Ásványianyag-tápoldat előkészítése A vizsgált oldatok elkészítéséhez megfelelő koncentrációjú ásványianyag-tápoldatokat tartalmazó törzsoldatokat kell készíteni. Törzsoldatok: a) Kálium-dihidrogén-foszfát, KH2PO4 8,50g Dikálium-hidrogén-foszfát, K2HPO4 21,75g Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát, Na2HPO4. 2 H2O 33,40g Ammónium-klorid, NH4Cl 0,50g Ezen anyagokat fel kell oldani vízben, és kiegészíteni 1 literre. Az oldat pH-jának 7,4-nek kell lennie. b) Kalcium-klorid, vízmentes, CaCl2 27,50g vagy kalcium-klorid-dihidrát, CaCl2 ·2 H2O 36,40 Ezen anyagokat fel kell oldani vízben, és kiegészíteni 1 literre. c) Magnézium-szulfát-heptahidrát, MgSO4. 7 H2O 22,50g Ezt az anyagot fel kell oldani vízben, és kiegészíteni 1 literre. d) Vas(III)-klorid-hexahidrát, FeCl3. 6H2O 0,25g Ezt az anyagot fel kell oldani vízben, és kiegészíteni 1 literre 10 ml (a) oldatot 800 ml hígítóvízzel kell összekeverni, 1 ml (b)–(d) oldatot kell hozzáadni, majd 1 literre hígítóvízzel kiegészíteni.

12. Inokulum • Inokulum források: lehet eleveniszap, szennyvíztisztítóból kifolyt víz (nem klórozott), felszíni víz és talaj, vagy ezek vegyesen. • A respirometriás vizsgálatok esetében, ha eleveniszapot használnak, azt döntően háztartási szennyvizet befogadószennyvíztisztító telepből vagy egységből kell venni. 1. Az eleveniszap-mintát frissen kell összegyűjteni valamely, döntő részben háztartási szennyvizet feldolgozó szennyvíztisztító telep vagy egység levegőztető tartályából. 2. Finom szűrőn keresztül kell átszűrni a vett eleveniszap mintát. 3. Aerob módon kell tárolni az iszapot. 4. A koncentrált iszapot az ásványianyag-tápoldatban kell szuszpendálni, a 3–5 gramm szuszpendált szilárd anyag/liter koncentráció elérése érdekében. 5. Levegőztetni kell, amíg szükséges. • Előkondicionálás: Az előkondicionálás az eleveniszapnak ásványianyag-tápoldatban vagy másodlagos szennyvízben 5–7 napon keresztüli, a vizsgálati hőmérsékleten végrehajtott levegőztetéséből áll. Az előkondicionálás esetenként javítja a vizsgálati módszerek pontosságát a vakpróba értékek csökkentésével.

13. Lombikok • A lombikok előkészítése: • A vizsgált és referenciaanyagból külön lombikokban oldatokat készítenek ásványianyag-tápoldatban, a törzsoldatok felhasználásával úgy, hogy az oldatok koncentrációja általában 100 mg anyag/liter legyen, ami legalább 50–100 mg ThOD/liter-értéknek felel meg. • Ki kell számítani a ThOD-t • A pH-értékeket be kell állítani azokat 7,4 ± 0,2-re. A lombikok száma egy tipikus vizsgálatsorozatban: 1. és 2. lombik: vizsgált szuszpenzió (vizsgált anyagot és inokulumot tartalmaz) 3. és 4. lombik: inokulum-vakpróba (csak inokulumot tartalmaz) 5. lombik: eljáráskontroll (referenciaanyagot és inokulumot tartalmaz)

14. A teszt kivitelezése • Miután a lombikok elérték a kívánt hőmérsékletet, azokat be kell oltani a megfelelő előkészített eleveniszappal vagy más inokulumforrással úgy, hogy a kapott szuszpendált szilárd anyag koncentrációja ne legyen 30 mg/l-nél nagyobb. • Össze kell szerelni a berendezést, elindítani a keverőt, és ellenőrizni a légmentes záródást, majd meg kell kezdeni az oxigénfelvétel mérését. • (mért értékek leolvasása és azok napi ellenőrzése, hőmérséklet és keverés ellenőrzése) • Az oxigénfelvételt a rendszeres és gyakori időközönként leolvasott értékekből lehet kiszámítani. • Az inkubálás végén, általában a 28. napon, meg kellmérni a lombikok tartalmának pH-ját. • (Amikor a nitrogént tartalmazó vizsgált anyag oxigént vesz fel, meg kell határozni a nitrit és a nitrát koncentrációjának növekedését a 28 nap alatt, a nitrifikáció következtében elfogyasztott oxigén figyelembevételével.)

15. (vegyi anyag által felvett O2 (mg) – kontroll által felvett O2[mg]) BOI Az eredmények kiértékelése El kell osztani valamely adott időt követően (az ugyanennyi idő után a vakpróbainokulum-kontroll által felvett oxigén figyelembevételével helyesbített) a vizsgált vegyi anyagra vonatkozó oxigénfelvételt (mg) a felhasznált vizsgált anyag tömegével. Ezzel megkapják a mg oxigén/mg vizsgált anyag hányadosakéntkifejezett BOI*-t,vagyis (BOI=biológiai oxigénigény = angolul BOD) A százalékos biológiai lebomlás kiszámítható a következő összefüggéssel: BOI Nitrogéntartalmú vizsgált anyagokhoz a megfelelő ThOD-t kell használni (NH4 vagy NO3) annak megfelelően, hogy várható-e nitrifikáció, vagy sem. • Az eredmények érvényessége: • Az inokulum-vakpróba oxigénfelvétele általában 20–30 mg O2/liter, és nem szabad, hogy 60 mg/liternél nagyobb legyen 28 nap alatt. 60 mg/liternél nagyobb értékek esetében alaposan meg kell vizsgálni az adatokat és a kísérleti módszereket. • Ha a pH-érték kívül van a 6–8,5-ös tartományon, és a vizsgált anyag által felvett oxigén kevesebb mint 60 %, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni a vizsgált anyag kisebb koncentrációjával.

16. Rövidítések Biológiailag könnyen lebontható: Olyan vegyi anyagok tetszőleges kategorizálása, amelyek megfeleltek bizonyos, a teljes biológiai lebonthatóság meghatározott szűrési vizsgálatok követelményeinek; e vizsgálatok olyan szigorúak, hogy feltételezhető, hogy az ilyen vegyületek vizes környezetekben aerob körülmények között biológiailag gyorsan és teljesen lebomlanak. DO: Oldott oxigén: (mg/l) az oldott oxigén koncentrációja valamely vizes mintában. BOI: Biokémiai oxigénigény: valamely vizsgált vegyület metabolizálásakor a mikroorganizmusok által felhasznált oxigén mennyisége; g oxigénfelvétel/g vizsgált vegyületként kifejezve is használják. Angolul: BOD KOI: Kémiai oxigénigény (g): valamely vizsgált vegyületnek forró, savas, dikromáttal végrehajtott oxidálása során felvett oxigén mennyisége; megadja a jelen lévő oxidálható anyag mennyiségének mértékét; oxigénfelvétel (g)/vizsgált vegyület (g) formában is használják. Angolul: COD DOC: Oldott szerves szén: az oldatban jelen lévő szerves szén, amely átszűrhető 0,45 mikrométeres szűrőn, vagy 15 percig tartó 40 000 m*s–2 (± 4 000 g) intenzitású centrifugálást követően a felülúszóban marad. ThOD: Elméleti oxigénigény (mg): valamely vegyi anyag teljes oxidálásához szükséges teljes oxigénmennyiség; a molekuláris képletből számítják ki, és oxigénigény (mg)/vizsgált vegyület (mg) formában is használják. ThCO2: Elméleti szén-dioxid-felszabadulás (mg): az a számított szén-dioxid-mennyiség, amelynek létre kell jönnie a vizsgált vegyület ismert vagy mért széntartalmából, a teljes ásványosodás során; fejlődött szén-dioxid (mg)/ vizsgált vegyület (mg) formában is használják.

17. Források • OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS • Test No. 301 - Ready Biodegradability • 440/2008/EK RENDELET (2008. május 30.) • A vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról • (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében • alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról • C RÉSZ: AZ ÖKOTOXICITÁS MEGHATÁROZÁSÁNAK MÓDSZEREI • C.4. A „GYORS” BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG MEGHATÁROZÁSA • http://www.mokkka.hu • http://www.enfo.hu/drupal/