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Eletroforese. Eletro f ores e. É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico. É usado para separar e analisar biomoléculas. Princípio:
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Eletroforese • É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico. • É usado para separar e analisar biomoléculas. • Princípio: Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre, deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável. • Para que uma partícula se mova é necessário que possua carga elétrica livre, isto é, excesso ou diferença de elétrons. • Portanto: - para o ânodo (+) dirigem-se os ânions - para o cátodo (-) dirigem-se os cátions
Eletroforese • As moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a carga elétrica e a forma. • Separa-se partículas de mesma carga, porém com quantidades diferente de carga. • Tipos de eletroforese - Livre - Anticonvectante - Carga da partícula - Peso da partícula - pH (solução tampão)
Moléculas grandes migram lentamente, enquanto moléculas pequenas movem-se rapidamente.
Eletroforese • Suportes: Meio sólido: - Papel - Acetato de celulose Meio semi-sólido: - Gel de amido - Gel de agarose - Gel de poliacrilamida
A técnica é tão sensível, que pode ser usada eficientemente para separar moléculas que diferem apenas muito sutilmente em suas cargas e/ou massas.
Eletroforese • Marcadores de peso molecular são usados para estimar o tamanho das moléculas das amostras.
Eletroforese: a concentração do gel • A concentração do gel definirá o tamanho dos poros a serem atravessados pelas moléculas em migração. • Geis muito concentrados oferecerão maior resistência à migração das moléculas.
Eletroforese: a concentração do gel • O grau de cross-links pode ser controlado pela razão de bis-acrilamida (cross-linker) e acrilamida (que forma os polímeros lineares), determinando o tamanho dos poros do gel. • 1 molécula de bis-acrilamida para cerca de 29 monômeros de acrilamida.
Tipos de gel de eletroforese • Gel de agarose • É um polissacarídeo; forma uma rede que segura as moléculas durante a migração. Preparo: pó de agarose e solução tampão (TBE). Após fundir, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA ou RNA "brilhar" quando exposto ao UV. Coloca-se o pente no gel. O pente cria poços que serão utilizados para a aplicação das amostras.
Tipos de eletroforese • Gel de poliacrilamida Acrilamida e Bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, A bisacrilamida é em forma de "T". • Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação.
Eletroforese capilar - Reduz o tempo de migração dos fragmentos de DNA substituindo a lâmina de gel por centenas de pequenos capilares (100 micra de diâmetro interno). - Aplicação de campos elétricos mais elevados para fazer com que os fragmentos se separem mais rapidamente. - O uso de um sistema de detecção através de fluorescência confocal, excitada por laser, torna possível a análise de mais de um capilar de cada vez. - Com a excitação e detecção confocal (uso de mesmos focos), em que a profundidade de campo do sistema ótico é suficientemente pequena para sondar apenas o interior de cada capilar, obtém-se alta resolução e eficiência de detecção.
Gel de eletroforese capilar Neste novo sistema, uma guarnição de capilares é colocada em um suporte e, sob controle computadorizado, cada capilar vai sendo submetido à varredura do feixe de laser. Os fragmentos de DNA, marcados com corantes de alta fluorescência, emitem fluorescência, que é filtrada e detectada por um fotomultiplicador
Eletroforese • Fatores que interferem na migração de partículas - Mobilidade - Diâmetro - Peso molecular - Força iônica - Viscosidade - Endosmose
Eletroforese: saída de força • A saída de força pode ser de diversos tipos: - Voltagem constante (mV) - Corrente constante (ampéres) - Força constante (watts)
Eletroforese • Proteínas: - aminoácidos como eletrólitos • Proteínas séricas: - Albumina - Globulinas (α1, α2, β, δ)
Eletroforese • LipoProteínas – unidade de transporte lipídico - Ultracentrifugação - Separação por eletroforese • Identificação de 4 faixas lipoproteicas - Quilomicrons - Lipoproteína Beta - Lipoproteína Pré-beta - Lipoproteína Alfa
Eletroforese • Hemoglobina - Hemoglobina anormais - Carga elétrica - Ponto isoelétrico - Hemoglobina S - Hemoglobina C - Talassemia Beta
Eletroforese • Hemoglobina S - Hemoglobinopatia estrutural * substituição do ácido glutâmico pela valina - Indivíduos homozigotos (SS) - Anemia hemolítica congênita ( anemia falciforme) - Indivíduos heterozigotos (AS) - Traço siclêmico - Geralmente assintomáticos
Eletroforese • Hemoglobina C - Hemoglobinopatia estrutural * substituição do ácido glutâmico pela lisina - Indivíduos homozigotos (CC) - Indivíduos heterozigotos (SC) - Anemia - Indivíduos heterozigotos (AC) - Raros sintomas clínicos - Detecção para aconselhamento genético
Eletroforese • Talassemia Beta - Depressão parcial ou total na síntese de cadeias beta da hemoglobina A - Indivíduos homozigotos - Anemia hemolítica grave - Indivíduos heterozigotos - Podem ser: assintomáticos anemia hipocrômica e microcítica anemia hemolítica leve/ moderada
Eletroforese: métodos de leitura Eluição
Eletroforese: métodos de leitura Densitometria
