ESPECTROFOTOMETRIA CROMATOGRAFIA ELETROFORESE

1. ESPECTROFOTOMETRIACROMATOGRAFIAELETROFORESE MÉTODOS BIOFÍSICOS DE SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES DE UMA SOLUÇÃO BIOLÓGICA

2. As soluções biológicas, além da água (solvente), possuem um número enorme de componentes (íons, pequenas moléculas, glicose, uréia, creatinina, colesterol, lipídios complexos...). • Estudar a composição quantitativa e qualitativa desses sistemas é indispensável. Os métodos biofísicos permitem separar e identificar esses componentes.

3. 1- ESPECTROFOTOMETRIA • POR MEIO DA ESPECTROFOTOMETRIA, COMPONENTES DESCONHECIDOS DE UMA SOLUÇÃO PODEM SER IDENTIFICADOS POR SEUS ESPECTROS DE COR

4. É o método óptico mais usado nas investigações biológicas e físico-químicas. • Métodocolorimétricoquepermitedetectar a concentração de compostospresentesemumasolução. • A energia utilizada é a luminosa – se baseia na absorção da luz pelo composto a ser medido • Por meio da espectrofotometria, componentes desconhecidos de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos

6. O olho humano percebe cores entre as faixas de 400 a 750 nm

7. ABSORÇÃO DA LUZ • A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui características de onda e de partícula (fóton) • A interação da luz com a matéria depende da estrutura química dos compostos • Compostoscorados – cromóforo • Reagentecromogênico • A reação entre o compostocromóforo e o reagentecromogênicoorigina um produtocolorido – quantomaisconcentrado – maiorquantidade de luzeleabsorve

8. A espectrofotometriaconsisteem: • Usar o espectro radiante (luz) para inspecionar sistemas biológicos, principalmente soluções. • Um feixe de energia atravessa a solução e a sua absorção oferece informações sobre a qualidade e quantidade dos Componentes do sistema • Luz Monocromática: • É a luz utilizada em experiências e em medidas espectrofotométricas • É aquela de um único comprimento de onda

9. Método de espectrofotometria • De absorção -É o processo fundamental -Passagem de um feixe de luz pela solução e mede-se sua absorção Aparelho utilizado é o espectrofotômetro que deve produzir a luz MC e medir a luz absorvida pelas soluções.

10. Curva de absorção espectral permite: • Identificar substâncias - são uma “impressão digital” • Identificar grupamentos químicos • Identificar a pureza de substâncias - quando a curva se afasta do esperado • Identificar os comprimentos de onda para dosagem da substância - escolher comprimento de onda que seja especificamente absorvido por aquela substância

12. Determinação da concentração da substância • É um dos métodos mais sensíveis e precisos • Quanto mais choques entre o feixe de energia e a matéria absorvente, mais energia é absorvida. É dependente de 2 fatores: • Trajeto óptico • Concentração • Quando a concentração da substância é constante, a absorção depende do comprimento do trajeto óptico. E quando o trajeto óptico é constante, a absorção dependerá da concentração

13. 2 - CROMATOGRAFIA • Método de separação e identificação de componentes dos sistemas biológicos (misturas) que consiste em movimentar o sistema, em condições apropriadas e separar espacialmente os componentes: a cada componente uma posição no trajeto. • As substâncias vão se movimentar pelo sistema em velocidades diferentes e se separarem

14. Ocorre pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. • Esses sistemas podem ser: sólido –líquido ou sólido-gás • A fase líquida é a móvel , solvente • A fase sólida é a fixa, suporte ou matriz • Analito: substância a ser analisada após separação

15. A cromatografia é um dos métodos de análise que tem grande utilização devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas • É uma técnica que separa os componentes por diferença de peso molecular, carga iônica e afinidade. • A cromatografia pode ser feita de vários modos, os mais comuns são: em colunas e em placas

16. Métodos cromatográficos Cromatografia de adsorção • Adsorção é a adesão física ou ligação de íons e moléculas na superfície de uma outra molécula. • CromatografiaemCamada Delgada • Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas) • As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.

18. Aplicabilidade na indústria farmacêutica • Controle de qualidade de ativos e formas farmacêuticas: • Determinação da porcentagem do princípio ativo, Quantificação das impurezas de um produto, • Determinação da composição ou formulação de um produto • Estudo de estabilidade e degradação de um produto Vantagens: • Alta precisão, curto espaço de tempo (1 a 20 minutos) - Métodos mais utilizados: • Cromatografia líquida (água, metanol, acetonitrila...) • Cromatografia gasosa (He, N2...)

19. 3- ELETROFORESE • É a separação de componentes de um sistema através da aplicação de um campo eletromagnético • Permite a separação de frações de moléculas orgânicas como RNA, DNA, proteínas e enzimas • O princípio básico consiste na migração de substâncias de acordo com suas cargas elétricas: - Componentes de carga negativa migrarão para o polo positivo - Componentes de carga positiva migrarão para o polo negativo

20. Deve-se levar em conta , além das cargas elétricas o peso molecular das partículas a serem separadas: • Quanto maior o peso molecular, mais lenta será a migração da partícula pelo gel e menor será a distância percorrida por ela

21. Fatores que condicionam a migração eletroforética • A velocidade de migração das partículas vai depender dos seguintes fatores: • Força do campo aplicado • Carga, tamanho e forma das moléculas • Viscosidade , pH e temperatura do meio • A voltagemaplicadaaosistemadeveseradequada: • Deve ser o mais rápido possível, para evitar que os componentes se difundam e se espalhem no sistema • Não pode ser muito alta, pois superaquece o sistema, prejudicando a separação dos componentes

22. Métodos de eletroforese EM GEL: - O mais usado é a poliacrilamida • Filtração pelos poros do gel (separa por tamanho da molécula), além da separação por cargas • Em gel de poliacrilamida com SDS: Proteínas são tratadas com sódio-Duodecil-Sulfato para igualar suas cargas (negativas) Serão separadas pelo peso molecular As mais leves chegarão primeiro ao polo positivo

26. Aplicabilidade prática • Estudo clínico do plasma: - Separação de proteínas no plasma ou no soro (mostra alterações peculiares de algumas patologias) • Há um elevado número de proteínas identificadas no soro, que diferem entre si estruturalmente e participam em vários processos fisiológicos. - A análise das proporções de suas frações tem considerável valor na abordagem de desordens agudas e crônicas, fornecendo informações clinicamente úteis.

27. Análise de DNA – teste de paternidade • Gel de agarose ou poliacrilamida • Em placa vertical • A amostra colhida é trabalhada para que haja fragmentação das tiras de DNA • As amostras são misturadas a um corante (bromofenol) leitura luz UV