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Técnicas de Eletroforese

Técnicas de Eletroforese. Rodrigo Rocha Latado. Eletroforese. Diversos métodos para análise de: Ácidos nucléicos (DNA e RNA) Proteínas Enzimas. ETAPAS Preparar a amostra ( DNA total, Produtos de PCR, Proteínas, etc...) Preparar o gel Aplicar as amostras no gel Eletroforese

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Técnicas de Eletroforese

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Presentation Transcript

  1. Técnicas de Eletroforese Rodrigo Rocha Latado

  2. Eletroforese Diversos métodos para análise de: • Ácidos nucléicos (DNA e RNA) • Proteínas • Enzimas

  3. ETAPAS • Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR, Proteínas, etc...) • Preparar o gel • Aplicar as amostras no gel • Eletroforese • Coloração do gel, Fixação, Documentação

  4. CLASSIFICAÇÃO • Tipos: - agarose - poliacrilamidadesnaturante não desnaturante - amido (para isoenzimas) • Princípios: - carga elétrica e tamanho da molécula (partícula) - pH (focalização isoelétrica)

  5. Detecção: • brometo de etídeo, SYBR, nitrato de prata, fluorescência • substratos específicos (isoenzimas) • Visualização: • UV, direta, câmera

  6. Eletroforese Sharp, Sambrook and Sugden

  7. Eletroforese Singer VL, Lawlor TE, Yue S. 1999. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat. Res. 439(1):37-47. Syber green http://www.probes.com/servlets/product?region=0&item=7563

  8. Àcidos Nucléicos • Ácido nucléico exposto a campo elétrico migra para eletrodo na velocidade ou mobilidade proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula • mobilidade: inversamente proporcional ao coeficiente friccional • coeficiente friccional: função do tamanho e forma da molécula e viscosidade do meio

  9. Eletroforese • Moléculas separadas por: • tamanho • forma ou conformação • magnitude de cargas • Sob pH fisiológico -> fosfatos ionizados • poliânions correm em direção ao eletrodo positivo • Eletroforese pólo negativo -> pólo positivo

  10. Eletroforese

  11. Eletroforese • Tamanho da Molécula de DNA • DNA linear migra inversa/ proporcional ao log10 do seu peso molecular

  12. Eletroforese • AGAROSE: • polissacarídeo linear de galactose com unidades de b-D-galactopiranose com ligações 1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose • PM médio: 120.000 Da

  13. Agarose

  14. Eletroforese em gel de agarose - Tampão (TAE ou TBE) e agarose - Concentração agarose varia entre 1 e 3% - Fundir a agarose no tampão e aplicar na fôrma - Esperar esfriar, retirar o pente - Aplicar as amostras no gel - Iniciar a eletroforese

  15. Eletroforese • Tampões: água eletrolisada gerando H+ • no anodo e OH- no catodo • terminal catódico (+) -> básica • terminal anódico (-) -> ácida • requer tampão para evitar gradientes de pH

  16. Eletroforese

  17. Eletroforese • TAE • para recuperação de fragmentos • preferido moléculas maiores • menor campo de força • maior porosidade • TBE • preferido para moléculas menores < 1Kb • interage com agarose - poros menores

  18. Eletroforese • Voltagem • expressar sempre em V cm-1 • gradiente de voltagem - distância entre eletrodos • voltagem excessiva - rastro de banda • voltagem baixa - difusão de bandas pequenas <1 Kb • TBE - bandas pequenas mais finas • TAE - bandas maiores

  19. Eletroforese

  20. Eletroforese • Tempo de corrida • correr gel até banda de interesse ter migrado de 40 a 60% do comprimento do gel • parte inferior do gel - difusão e dispersão

  21. Eletroforese • Tampão de Carregamento: • Concentração 6 a 10x • aumentar densidade da amostra - depositar amostra no fundo do poço • adicionar cor a amostra • adicionar corantes de mobilidade ou migração • azul de bromofenol • xileno cianol • verde de bromocresol

  22. Eletroforese- Poliacrilamida

  23. GEL DE POLIACRILAMIDA - Géis de Poliacrilamida são obtidos a partir da formação de ligações entre o polímero acrilamida e o co-monômero bis-acrilamida. - Essa reação covalente é geralmente catalizada por persulfato de amônio e iniciada por TEMED, uma amina terciária. - Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida através de variações de: • Concentração de acrilamida e bis-acrilamida • Grau de polimerização

  24. GEL DE POLIACRILAMIDA - A matriz de poliacrilamida por possuir poros menores do que a matriz de agarose, géis de acrilamida são usados para separar fragmentos de DNA menores que 2 kpb, enquanto que moléculas de até 200 kpb podem ser separaradas em géis de agarose. - De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp, enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1 a 0,05 Kpb.

  25. Eletroforese

  26. ACRILAMIDA DESNTAURANTE • - Acréscimo de Uréia no gel para a manutenção do DNA na • forma de fita simples • - Amostras de DNA são desnaturadas a 94 -96o C, na • presença de Formamida, antes da eletroforese

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