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Diagnóstico Laboratorial das Hepatites A, B e C

Diagnóstico Laboratorial das Hepatites A, B e C. Amadeo Sáez-Alquézar Vitória 2008. Hepatites por Vírus Até 1965. A. Hepatite Infecciosa. Curto período de incubação. B. Hepatite por soro homólogo. Longo período de incubação. Hepatites Virais. Hepatite por vírus A HAV

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Diagnóstico Laboratorial das Hepatites A, B e C

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Presentation Transcript

  1. Diagnóstico Laboratorial das Hepatites A, B e C Amadeo Sáez-Alquézar Vitória 2008

  2. Hepatites por VírusAté 1965 A Hepatite Infecciosa Curto período de incubação B Hepatite por soro homólogo Longo período de incubação

  3. HepatitesVirais • Hepatite por vírus A HAV • Hepatite por vírus B HBV • Hepatite por vírus C HCV • Hepatite por vírus D HDV • Hepatite por vírus E HEV • Hepatites Não A-E HGV.. Vírus Epstein Bar, Citomegalovírus, Herpes, outros

  4. Hepatites Virais Mais Frequêntes

  5. Características das Hepatites

  6. Hepatites Não A-EVírus da Hepatite G ou GB-C

  7. Diagnóstico das Hepatites por Vírus • Testes sorológicos. • Marcadores sorológicos (Ac, Ag). • Testes de biologia molecular. • Amplificação de ácidos nucléicos. • Testes bioquímicos. • Enzimas, pigmentos biliares, proteínas.

  8. HAV e HEV • Distribuição mundial • Transmissão entérica (fecal-oral) • Não apresentam formas crônicas • Hepatite aguda grave: • HAV • Crianças < 1%; adultos >2% • HEV:em gestantes • 15 – 25%

  9. HAV: Prevenção da Infecção • Melhoria dos Padrões Sócio-econômicos e de Higiene. • Em áreas endêmicas para HAV: A vacinação de crianças é mandatoria. • A imunogenicidade da vacina para hepatite A é muito alta, obtendo-se 97% a 100% de soro conversão após uma única dose e de 100% com a segunda dose. • Vacinar viajantes de áreas não endêmicas para áreas endêmicas. Vacinas: Havrix® e Vaqta®

  10. Transmissão da HVA • Porcontato pessoal • Doméstico, sexual, crianças em locais de estudo e recreação. • Por água e alimentos contaminados. • Pelo sangue (rara) • Uso de drogas endovenosas. • Transfusão sangüínea

  11. HVA - Características Clínicas • Período de incubação: 30 (15-50) dias • Icterícia por faixa etária • < 6 anos: < 10% • 6 a 14 anos: 40 – 50% • > 14 anos: 70 – 80% • Complicações: raras • Formas crônicas: ausentes

  12. Distribuição geográfica da infecção pelo vírus da Hepatite A CDC

  13. HAV Estrutura e variabilidade genética • Estrutura icosahédrica • Não envelopado • Genoma: fita única de RNA • 7500 nucleotídeos (3 regiões) • Região codificadora (P1 – P2 – P3) • 4 proteínas virais: VP1, VP2, VP3 e VP4 • Três Genótipos (15% de variações no VP1) • Um único sorotipo P2: Proteínas nâo estruturais (2A, 2B e 2C) P3: Proteinas estruturais (3A, 3B, 3C e 3D)

  14. Marcadores Sorológicosda Hepatite por Vírus A • Anti-VHA (IgM) • Anticorpos contra o VHA, subclasse IgM • FASE AGUDA • Anti-VHA (IgG) • Anticorpos contra o VHA, subclasse IgG • RECUPERAÇÃO - IMUNIDADE

  15. Viremia VHA Nas fezes

  16. HRP AgHAV Positivo Imuno Captura : IgM reverso anti-HAV (IgM), anti-HBc (IgM), anti-Delta (IgM) H2O2/TMB H2SO4 Fase sólida

  17. Paraná R & Schinoni MI HVE Características Clínicas • Período de incubação::40 (15 – 60) dias • Formas graves:1% - 3% • Gestantes:15% - 25% • Gravidade:aumenta com a idade • Formas crônicas::não identificadas.

  18. HEV – Características epidemiológicas • A maioria dos surtos estão associados à ingestão de água contaminada com fezes. • A transmissão, pessoa a pessoa, é mínima. • Frequêntemente descrita em viajantes para áreas endêmicas.

  19. Distribuição geográfica da infecção pelo vírus da Hepatite E CDC Surtos de infecção confirmada em > 25% de hepatites esporádicas Não ABC

  20. Marcadores Sorológicos para o Vírus da Hepatite E • Anti-HEV IgM • Fase aguda • Diagnóstico • Anti-HEV IgG • Recuperação • Prevalência

  21. Prevalência de infecção por HEV e HAV - Rio de Janeiro TRINTA, Karen S, LIBERTO, Maria Isabel M, PAULA, Vanessa S de et al. Hepatitis E virus infection in selected Brazilian populations. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Jan. 2001, vol.96, no.1, p.25-29.

  22. Infecção pelo HBV • A prevalência da infecção por HBV, no mundo, é estimada em torno de 4 – 5% da população total do planeta. • Portadores crônicos assintomáticos • Hepatite crônica (350 milhões) • Carcinoma Hepatocelular (HCC) • Estima-se que ocorrem 50 milhões de novos casos, por ano, de infecção pelo HBV.

  23. HBsAg Prevalência 8% - Alta 2-7% - Intermediária <2% - Baixa Distribuição Mundial da Infecção Crônica por HBV CDC

  24. Formas de Transmissão do HBV • Exposição per cutânea e de mucosas a fluídos corporais contaminados. • Contato sexual • Transfusão sangüínea • Transplante de órgãos • Vertical (mãe p/ o recém nascido) • Uso de agulhas e seringas contaminadas • Acidentes em laboratório

  25. 5-10% Infecção crônica 80% Assintomática 20% Doença Aguda >1% Hepatite Fulminante 5% a 10% 30% Hepato carcinoma Cirrose 23% Em 5 anos Crianças Transplante ou óbito Falência hepática Quase sempre Sub-clínica Infecção pelo HBV Adultos

  26. Infecção Crônica por HBV

  27. HBV - PREVENÇÃO • Imunização passiva • Imuno globulina • Proteção curta (2 – 3 meses) • Imunização ativa • Vacina • Proteção longa (anos) • Plasma purificado (1981) • Vacina recombinante (1986)

  28. VACINA HBV • Esquema • Três doses (0-1-6 meses) • Não é necessário reiniciar, se passou o tempo estabelecido entre as doses. • Eficacia • Resposta adequada: anti-HBs > 10UI/ml • Proteção (> 15 anos) • 1ª dose: 30-50% - 2ª dose: 75% - 3ª dose: 96% • Menor em imunodeprimidos e idosos

  29. Vírus da Hepatite B

  30. Marcadores sorológicosda Hepatite por Vírus B • AgHBs • Anti-HBs • AgHBe • Anti-HBe • Anti-HBc (IgM) • Anti-HBc (IgG ou total)

  31. HBV-DNA

  32. Perfis Sorológicos Observados em Indivíduos Infectados pelo HBV

  33. Interpretações para o anti-HBc (+) com AgHBs/anti-HBs (-) 1-Resultado falso positivo para o anti-HBc. Mais de 66% dos indivíduos com AgHBs negativo, anti-HBc positivo e anti-HBs negativo, quando submetidos à vacinação contra o HBV soroconvertem, com positividade para o anti-HBs, o que indicaria que o anti-HBc isolado correspondia a um resultado falso positivo. 2-Infecção passada pelo HBV e que após algum tempo desapareceu o anti-HBs. 3-O AgHBs está en níveis muito baixos, ou se encontra formando imunocomplexos com o anti-HBs, de modo que não pode ser detectado. 4-Mutantes AgHBs. Ainda que as provas para detecção do AgHBs apresentem alta sensibilidade, alguns testes podem não detectar mutantes.

  34. HBV – DNA circular de hélice dupla parcialmente fechada e envelope lipídico 4 Regiões abertas para leitura S P C X Genoma: 3.200 nucleotídeos

  35. Pré S1 Pré S2 gene S gene C Pré C GENOMA DO HBV AgHBs DNA Polimerase gene P AgHBc AgHBe

  36. HBV: Replicação e Variantes • Replica seu genoma (DNA) via transcrição reversa do RNA pré-geonómico • Inserção incorreta de nucleotídeos no cDNA • Geração de “quasiespécies” • Alta replicação viral: 1012-13 por dia • Alta taxa de mutações

  37. HBV – AgHBs – Variantes • Subtipos • O AgHBs possui diversas proteínas • Determinantes antigênicos (a, d, y, w, r) • Combinações: subtipos • Mais comuns: adw, adr, ayw. • O determinante antigênico “a” é comum a todos os subtipos • Genótipos • Baseados na divergência genética de 8%, ou mais, da sequência completa de nucleotídeos • Genótipos: A, B, C, D, E, F, G, H • Mutantes

  38. Genótipos A B C D E F G H A/D B/C Ba Bj A D A C G A D Bj G D Ba B E H F B C D A Distribuição Geográfica Genótipos do HBV Baseados na divergência genética de 8% ou mais da sequência completa de nucleotídeos Stuyver et al., J Gen Virol. 2000;81(1):67-74. deMan et al., J Hepatol. 1998;29(4):669-75.

  39. Variantes do HBV • Os subtipos e genótipos do HBV se originam de forma natural durante o curso da infecção pelo HBV • Consolidadas na natureza • Apresentam distribuição étnica e geográfica características

  40. Mutantes do HBV • Gerados espontaneamente durante o curso da infecção natural pelo HBV • Gerados num ambiente de pressão seletiva • Uso de imuno profilaxia ativa • Uso de imuno profilaxia passiva • Tratamento com anti-virais

  41. Principais Mutantes do HBV • Mutantes pré-Core ou Core promoter • Achados em cepas mais virulentas • Mutantes no gene P (polimerase) • Resistência a anti-virais • Mutantes no gene X • Associados ao desenvolvimento de hepatocarcinoma • Mutantes no gene S • Modificam os epítopos imunodominantes do determinante antigênico “a”

  42. Principais Mutações do HBV • Na região pré core do DNA-HBV (mutantes de escape do AgHBe) • Falha na expressão do AgHBe a partir da região Pré-Core • Ex: aa gly, substituído pelo aa arg • [PCR DNA-HBV (+) e AgHBe (-)] • Resistência aos anti-virais • Mutações na Polimerase • Lamivudina • Adefovir

  43. SHAgHBs com 226 aa MHAgHBs com 281 aa LHAgHBs com 345 aa S S/pré-S1 S-pré-S1/pré-S2 Estrutura antigênica do AgHBs O envelope do HBV contem 3 proteínas (complexo AgHBs) Codificadas pelo gene S do genoma viral REGIÕES Região hidrofílica globular: aas 99 a 169 do SHAgHBs DETERMINANTE ANTIGÊNICO “a” aas 121 – 149 da região S

  44. Determinante Antigênico “a” • É comum a todos os sub-tipos do HBV • Tem afinidade com o determinante “a” • Acs contra o AgHBs na infecção pelo HBV • Acs após a vacinação • Acs das gamaglobulinas específicas policlonais (HBIg) • Acs dos kits diagnósticos para a detecção de AgHBs

  45. Principais Mutações do HBV • No determinante antigênico “a” • Gly (145) substituída por arg • Lys (141) substituída por glu • Vacina, HBIG e diagnóstico “escape” • G145R, K141E (Alça 2 “determinante a”) • T126S,T131N (Alça 1 “determinante a”) • G145R • Descrita mais frequentemente em pacientes vacinados, mas também em portadores crônicos não vacinados

  46. Alça 1do determinante “a” 121 124 s-s- 126 Vaccine Escape Mutants: T126S T131N M133LK141E D144E G145R N144R Thr143Leu Ser 143Leu Y 158 131 F 99 133 G130N res à lamivudina --s--s- 149 137 164 E -s-s- D 107 s-s- 138 139 147 145 195 141 G R 144 I D M E W S M 196 Alça 2 do determinante “a” 210 198 (Carman, W. J Viral Hepatitis 1997 4: 11-20) I

  47. Mutações do AgHBs • Diagnóstico de HBV em indivíduos AgHBs negativos • Importância dos Ac monoclonais / policlonais • Falha na vacinação de recém nascidos de mães Ag HBs positivas (0,6 – 4,0%) • Falha na imuno profilaxia em receptores de transplante ortotópico de fígado (11 -66%) • Falhas no tratamento com antivirais

  48. Anti-HIV1/2 (2) Anti-HTLVI/II (1) Anti-HCV (1) Ag HBs (1) Anti-HBc (1) Sífilis (1) Chagas (2) ALT (1) Anti-HIV1/2 (2) Anti-HTLVI/II (1) Anti-HCV (1) Ag HBs (1) Anti-HBc (1) Sífilis (1) Chagas (1) ELISA Alta sensibilidade BRASIL –Testes obrigatórios na triagem sorológica de doadores de sangue Nº 1.376 Nov / 93 Nº 2.009 Out / 96 Nº 488 / 98 RDC Nº 343 Dez / 2002 RDC Nº 153 Junho / 2004

  49. Testes para detecção doAgHBs • Sensibilidade • Especificidade • Detecção de mutantes

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