1 / 45

DNA onderzoek

DNA onderzoek. DNA onderzoek in het WFG. Doel: de vier laboratoria Medisch Microbiologisch Laboratorium Pathologisch Anatomisch Laboratorium Klinische Farmacie Klinisch Chemisch Laboratorium. ondersteunen alle specialismen in hun DNA onderzoek. Welk type DNA onderzoek?.

toni
Download Presentation

DNA onderzoek

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNA onderzoek

  2. DNA onderzoek in het WFG • Doel: • de vier laboratoria • Medisch Microbiologisch Laboratorium • Pathologisch Anatomisch Laboratorium • Klinische Farmacie • Klinisch Chemisch Laboratorium ondersteunen alle specialismen in hun DNA onderzoek

  3. Welk type DNA onderzoek? • Is er DNA of RNA aanwezig? • Is de DNA volgorde wel goed? • Welk DNA is nu actief?

  4. Welk type DNA onderzoek? • Is er DNA of RNA aanwezig? • Is de DNA volgorde wel goed? • Welk DNA is nu actief?

  5. Welk type DNA onderzoek? • Is er DNA of RNA aanwezig? • Is de DNA volgorde wel goed? • Welk DNA is nu actief?

  6. Is er DNA of RNA aanwezig? • Principe: • Van RNA eerst cDNA maken (RNA virus) • DNA vermenigvuldigen tot een bepaalde hoeveelheid kleur wordt gemeten. • Geen kleur geen RNA / DNA, • Veel kleur veel RNA of DNA • (concentratie DNA/RNA is hier mee te meten)

  7. RNA DNA CH3 Thymidine

  8. Is er DNA aanwezig en ja hoeveel? ?

  9. PCR

  10. PCR

  11. PCR

  12. Reporter Quencher TaqMan PCR Excitation Emission FRET Amplicon ANNEALING EXTENSION Amplicon 5’-3’ exonuclease

  13. Hardware

  14. Threshold Cycle PCR quantitation Microbial Load Testing 2.5 NEG 10 100 F2/F1 1.5 1000 10.000 100.000 1.000.000 0.5 0 10 20 30 40 50 60 70 Cycles

  15. Threshold Cycle Concentration log 10 2.5 Test Sample Threshold F2/F1 1.5 Threshold Cycle 0.5 0 10 20 30 40 50 60 70 Cycles Threshold Cycle = 35 Load = 103.8 copies/ml

  16. HPV-DNA wel of niet aanwezig? • HPV is dubbelstrengs DNA Virus • Nodig? • Automatisch extractie apparaat • Real time PCR Positieve uitslag HPV typeren door specifieke RT-PCRs in te zetten Activiteit van HPV bepalen via RNA onderzoek

  17. Is er RNA of DNA aanwezig? • S. aureus • S. pyogenes • S. pneumoniae • S. viridans groep • N gonorrhoeae en meningitidis • H. influenzae • E. coli, Salmonella • Pseudomonas • MRSA TOP 13 maken?

  18. Pat. 1 Pat. 2 Pat. 3 Pat. 4 Infectie ja of nee? 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 C N P 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 C N P 1 2 3 4 5 6 7 8 P 9 10 11 12 13 C N 1 2 3 4 5 6 7 8 Uitslagen binnen 4 uur bekend

  19. Welk type DNA onderzoek? • Is er DNA of RNA aanwezig? • Is de DNA volgorde wel goed? • Welk DNA is nu actief? Cytochroom P450 onderzoek

  20. Meerdere Genen tegelijk!een droom-experiment • in één enkel experiment bij een cel vaststellen welke genen wel en welke genen niet aan staan • mens: 30.000 genen • het is mogelijk...! • DNA micro-arrays • DNA chips

  21. Gen activiteiten bij tumoren

  22. RNA van gen 1 RNA van gen 2 RNA van gen 3 hoe meet je de activiteit van een gen? • alleen genen die aan staan produceren RNA • hoe meer RNA hoe groter de aktiviteit van een gen

  23. genexpressie meten aan de hand van RNA concentratie in de cel celtype 2 celtype 1 • vier mogelijkheden • genen even actief in beide celtypen • genen aktiever in één van de celtypes • genen actief in slechts één celtype • genen inactief in beide celtypen

  24. A B C D E F 1 2 3 4 5 6 componenten van de DNA microarray technologie • duizenden spotjes op aan glaasje • elk spotje heeft stukjes DNA van een specifiek gen • 30.000 spotjes genoeg voor alle menselijke genen • in principe...

  25. * * * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie te analyseren cellen referentie cellen * * * * * * * * * isoleer RNA en maakhet fluorescerend GROEN isoleer RNA en maakhet fluorescerend ROOD

  26. * * * * * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * specifieke binding van alleen de juiste nucleotiden volgorde via dubbelstrengs DNA: A-T en G-C...!

  27. * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * alleen RNA van referentie cellen: dus spot is GROEN

  28. * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * *

  29. * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * *

  30. * * * * * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * alleen RNA van te analyseren cellen: dus spot is ROOD

  31. * * * * * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen *

  32. * * * * * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen *

  33. * * * A B C D E F 1 2 3 4 5 6 microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * RNA van referentie cellen en van te analyseren cellen: GROEN plus ROODis GEEL

  34. Genexpressie A B C D E F G 1 celtype 1 celtype 2 2 gen 1F - ++++ 3 - ++ 4 ++++ gen 3E ++++ 5 ++ - 6 gen 5C ++++ - gen 5B - - verband genexpressie enfluorescentiesignaal

  35. microarray met DNA spots van 7.500 genen van de muis

  36. microarray met DNA spots van 7.500 genen van de muis

  37. DNA microarray om genen te vinden in relatie tot een ziekte isolatie enlabelling gezond microarray ziek isolatie en labelling binden aan microarray spotjes meten data extractie + analyse identificatie van genen met andere activiteit bij ziekte

  38. goede prognose slechte prognose 70 genen geïdentificeerd die verloop van het ziekte goed kunnen voorspellen metastases 70 geselecteerde genen rangorde (wit = +) 78 tumoren

  39. ~30% patiënten overlijdt aan borstkanker binnen 10 jaar ~70% overleeft 10 jaar of meer toepassing microarray diagnostiek van borstkanker traditionele diagnostiek overlevenden iedereen krijgt chemotherapie...! tijd (jaren)

  40. overlevenden tijd (jaren) identificatie van genen waarvan de activiteit verandert bij borstkanker • analyse van 78 humane borsttumoren • 34 metastase-positief binnen 5 jaar • slechte prognose • 44 metastase-negatief gedurende 5 jaar • goede prognose

  41. 96% 5 % laag risico 95 % hoog risico 39 % laag risico 61 % hoog profiel 50% 74% 59% classificatie op basis van microarray klassieke NIH classificatie microarray classificatie vs. NIH classificatie • classificatie van 158 borstkanker-tumoren • minder onnodige chemo-therapie • identificatie van genen die een rol spelen bij borstkanker

  42. DNA onderzoek Is er RNA of DNA aanwezig Is het DNA wel goed MML PAL KF KCL Welk DNA is actief

More Related