Estudo de doenças Auto-imunes

Estudo de doenças Auto-imunes Doenças Autoimunes endócrinas Prof.Doutor José Cabeda

LES Lúpus discóide Esclerodermia Citopenias autoimunes Síndrome de Goodpasture Cirrose Biliar Primária Hepatite crónica activa Síndrome Guillain-Barré Uveite Fibrose Pulmonar Idiopát. Artrite reumatóide Artrite reumatóide juvenil Sindrome de Sjögren DMID (Diabetes ) Psoriase Doença de Graves Doença de Hashimoto Esclerose Múltipla Colite ulcerosa Doença de Chron Miastenia Gravis Patologias autoimunes sistémicas e de órgão Prof. Doutor José Cabeda

Doenças Autoimunes endócrinas • Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto) • Doença de Graves • Diabete Melitus dependente de Insulina • Doença da Addison Prof. Doutor José Cabeda

Auto-antigénios de Doenças Autoimunes endócrinas • Tiroidite crónica • Tiroglobulina • Peroxidase da Tiroide (TPO) • Doença de Addison • Antigénios Adrenais • Ovario, Testiculos, Placenta (uso em investigação) • Hipoparatiroidismo • Antigénios da paratiróide (Ag citoplasmáticos) • Anemia Perniciosa • Células parietais gástricas (subunidades a e b da ATPase H/K) • Doença de Graves • TSH-R (Receptor da Hormona pituitária tirotropina ) • TSAb imita a acção da TSH • TBAb bloqueia a acção da TSH (existe no hipotiroidismo) • Testar a presença com células RFTL-5 ou substituto Prof. Doutor José Cabeda

Diabetes Mellitus • Causada pela destruição das células beta do pâncreas, mediada por células T • Estudo da função celular T não é prática • Presença de Autoanticorpos é marcador da doença • Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios das células beta, devido à sua destruição • Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com a evolução da doença • Testados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISA Prof. Doutor José Cabeda

Auto-antigénios na IDDM • Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA) • Existem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novo • Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD) • Bandas de 64Kd e 50Kd • Insulinoma Antigen (40 e 37Kd) • IA-2 • IA-2b • GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes) • Anti insulina (IAA) • Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novo • Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a probabilidade de o doente possuir IDDM Prof. Doutor José Cabeda

Auto-antigénios na IDDM Prof. Doutor José Cabeda

Estudo de doenças Auto-imunes Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso Prof.Doutor José Cabeda

Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso • Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto-anticorpos • Miastenia Gravis • Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na membrana pós-sináptica do musculo • Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES) • Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado pela voltagem, que regula a libertação do transmissor no terminal nervoso do músculo Prof. Doutor José Cabeda

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Estudo de doenças Auto-imunes Anemia Hemolitica Autoimune Prof.Doutor José Cabeda

Anemias Hemoliticas autoimunes Prof. Doutor José Cabeda

Anemias Hemoliticas autoimunes:Técnicas diagnósticas laboratoriais • Direct Antiglobulin Test (DAT) • Demonstra o “coating” dos RBC com Ab in vivo • Usado para investigar : • Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA) • Hemólise induzida por drogas • Doença Hemolitica do recém-nascido • Reacção aloimune á transfusão • Em WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estável • Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação atinge zonas mais quentes • Em PCM (semelhante ao CAD mas com IgG • sangue coag. Activ. complemento  falsos positivos Prof. Doutor José Cabeda

DAT: procedimento • Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento) • Preparar RBC (2-4%) em PBS • 1 gota RBC em 3 tubos (aIgG, aC3b/C3d, e albumina como controlo) • Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm) • Adicionar 2 gotas de aIgG, aC3b/C3d, e 6% albumina • Misturar e spin o tubo com aIgG 15’’-3400rpm • Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e microscópicamente para a presença de aglutinação • Incubar 5 min-RT os restantes tubos • Repetir 6 e 7 para os restantes tubos • Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio) a cada tubo negativo • Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10 • Em Indivíduos recentemente transfundidos separar os eritrócitos transfundidos (mais densos) por centrifugação. Se existir AIHA ambas as populações apresentam DTA positivo. Se apenas 1 população for positiva trata-se de Reacção transfusional tardia. Prof. Doutor José Cabeda

Eluição de anticorpos de RBC • Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas especificamente) • Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH (promove a dissociação dos anticorpos) • Centrifugar • Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos • Neutralizar o sobrenadante com solução tamponada Prof. Doutor José Cabeda

Determinação de amplitude térmica de auto-anticorpos • Cold reactive Ab reagem a 0-4ºC • Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC • Colher e manter amostra a 37ºC • Spin 3400rpm-1min • Incubar 5’ a 37ºC • 1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC • Agitar; incubar 1 hora a 37ºC • Spin 15’’-3400rpm e examinar macroscópicamente • Repetir 5 e 6 a 30ºC • Repetir 5 e 6 a 22ºC • Pos a 30 e 22ºC  Ig patológicas • Pos só a 22ºC Cold aglutinin • A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA Prof. Doutor José Cabeda

Indirect Antiglobulin Test (IAT):(Antibody screen for RBC-Ab) • Routine pre-transfusion test • Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados para aglutinação em 2 fases: • 37ºC com agente “enhancer”* • Após adição de a-IgG (reagente coombs) • Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os falsos positivos devidos a alo-anticorpos • WAIHA geralmente pan-RBC * BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente) Prof. Doutor José Cabeda

Estudo de Alergias Quantificação de alergénios Prof.Doutor José Cabeda

Estudo de Alergias Estudos in-vivo Prof.Doutor José Cabeda

Quantificação de Alergénios • Skin testing • Protein content • Quantificação de alergénios individuais (RIA,ELISA, etc) • Imunoelectroforese • PAGE • Imunobloting • Inhibition immunoassays Prof. Doutor José Cabeda

Skin testing • Para controlar a possibilidade de choque séptico • Médico disponível em SOS • Garrote disponível em SOS • 1 mg epinefrina disponível em SOS • Seringa hipodérmica com 100 mL alergénio • Injecção de 20-50 mL, cerca de 3mm diâmetro • Observação aos 15 min • Medir dois diâmetros e calcular média • Nova observação aos 30 min Prof. Doutor José Cabeda

Skin testing Prof. Doutor José Cabeda

Estudo de Alergias Testes Laboratoriais Prof.Doutor José Cabeda

Testes laboratoriais para estudo de alergias • Determinação de IgE total • Determinação de IgE específica para um alergénio • Screening multialergénico • Imunoblotting com alergénios • Medida de alergénios caseiros • Skin testing Prof. Doutor José Cabeda

Determinação de IgE total • Captura com aIgE conjugada com suporte sólido • Lavar • Reagir com aIgE marcada • Lavar • Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) Prof. Doutor José Cabeda

Determinação de IgE específica para um alergénio • Alergénio ligado a matriz sólida • Adicionar soro doente • Incubar e lavar • Reagir com aIgE marcada • Lavar • Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) Prof. Doutor José Cabeda

Multiple Alergen Screens • Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida • Ex: • Mistura de árvores • Mistura de relvas • Mistura de sementes • Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust mites • Pelo de cão e gato • Etc... Prof. Doutor José Cabeda

Specific IgE Inhibition immunoassays • Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em diluições sucessivas • Usar PBS como 0% inibição • Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro do doente e incubar 2 horas com agitação • Alergénio ligado a suporte sólido • Fazer um ensaio de detecção de IgE específica • Calcular a % inibição para cada diluição do inibidor • Fazer um plot da inibição em função da concentração de inibidor Prof. Doutor José Cabeda

Estudo de doenças Auto-imunes