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araC_lacI oscillator

araC_lacI oscillator. 1-1. promotor - RBS-adaptor- teminator を PCR で増やす - 2. GFP 、 lacI 、 araC のパーツを PCR で 増やす 2. promotor+RBS+adaptor+teminator をプラスミドの中に入れる 3. araC 、 GFP 、 lacI の ORF を HindIII で入れる 4. araC と GFP をつなぐ 5. araC_GFP 、 lacI を同時に大腸菌に入れる.

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Presentation Transcript

  1. araC_lacI oscillator • 1-1. promotor- RBS-adaptor-teminatorをPCRで増やす • -2. GFP、lacI、araCのパーツをPCRで増やす • 2. promotor+RBS+adaptor+teminatorをプラスミドの中に入れる • 3. araC、GFP、lacIのORFをHindIIIで入れる • 4. araCとGFPをつなぐ • 5. araC_GFP、lacIを同時に大腸菌に入れる

  2. Step1-1. promotor- RBS-adaptor-teminatorをPCRで増やす 方法: PCRで増やす Adaprtorの部位は backboneに切れる 場所がない酵素を選ぶ (検討中) 必要なもの: *注文したprimer *P1.1H Primerとして注文 P1.1H Adaptor(パーツ以外の制限酵素部位、HindIII) B0010 B0012 EcoRI XbaI speI pstI RBS 5’ 3’ ParaC/lacI HindIIIはpromotorに切れる場所があるので、直す

  3. Primer 5’側 Adaptor(パーツ以外の制限酵素部位、HindIII) EcoRI XbaI 3’ RBS 5’ ParaC/lacI Terminatorの最初の部分 配列 GAATTC CTTAAG TCTAGA AGATCT 5’ catagcatttttatccataagattagcggatcctaagcaatacaattgtgagcgctcacaattatgatagattcaattgtgagcggataacaatttcaca BBa_B0010 AAGCTT TTCGAA ccaggcatcaaataaaacg attaaagaggagaaa 3’

  4. Primer注文 3’側 speI pstI Teminatorの最後の部分 5’ 3’ 配列 gggcctttctgcgtttata のantisense GAATTC CTTAAG TCTAGA AGATCT BBa_B0012

  5. Step1-2. GFP、lacI、araCのパーツをPCRで増やす 方法: PCRで増やす 必要なもの: *注文したprimer *パーツ #GFP(P1.2B) #lacI(P1.7L、P1.2Oのどちらか) #araC(P1.14L) HindIII HindIII 5’ パーツのORF ssrA tag 3’

  6. primer 5’側 HindIII 5’ ORFの最初の部分 3’ 配列 5’ P1.2B Atggtgagcaagggcgagg AAGCTT TTCGAA 3’ GFP P1.2O/7L 5’ Atggtgaatgtgaaaccagtaacg AAGCTT TTCGAA 3’ lacI P1.14L 5’ Atggctgaagcgcaaaatgatcc 3’ AAGCTT TTCGAA araC

  7. Primer(続き) 3’側 HindIII ssrA tag 5’ ORFの最後の部分 3’ 配列 P1.2B Ggatgaactatacaaataataaのantisense AAGCTT TTCGAA GFP 5’ 3’ Acgcgtgcaaacgacgaaaactacgctttagcagcttaacgcgtのantisense P1.2O/7L Gctggcacgacaggtttccのantisense AAGCTT TTCGAA lacI 同上(ssrA tagのantisense) 3’ 5’ P1.14L Gccgtcaagttgtcagctのantisense 同上(ssrA tagのantisense) araC 3’ AAGCTT TTCGAA 5’

  8. Step2. promotor+RBS+adaptor+teminatorをプラスミドの中に入れる 必要なもの: Plasmid backbone *ColEI(P1.3D) *p15A(P1.9CとP1.9G、同じものだけどQualityに不安があるのでどちらもやる) 方法: パーツの制限酵素で切って貼る。 ぷちっ☆

  9. Step3. araC、GFP、lacIのORFをHindIIIで入れる araCとGFPはColEI、 lacIはp15Aに入れます。 間違わないように！！ よいしょ☆

  10. Step4. araCとGFPをつなぐ araCとGFPをつないで、１つのプラスミドに入れる

  11. Step5. araC_GFP、lacIを同時に大腸菌に入れる うまくいけば振動する。。。

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