IV. Přenos signálů-buněčné receptory

1. IV. Přenos signálů-buněčné receptory • Úvod • Sedm transmembránových helixových receptorů mění svoji konformaci po vazbě ligandu za současné aktivace G proteinů • Hydrolýza fosfatidylionositolbisfosfátů fosfolipasou C vede ke tvorbě dvou poslů • Vápenatý iont jako univerzální cytosolární posel • Dimerizace receptorů jako odezva na vazbu ligandu • Důsledky defektů přenosu signálů

2. Formy transdukce signálu • Receptory na membráně přenáší informaci z okolí do buňky. Některé nepolární signální molekuly (např. steroidní hormony) pronikají do buněk a tam se váží na protein nebo přímo na DNA. • Častější interkace ligand – receptor. Receptor je obvykle integrální protein membrány. Uvnitř buňky se tvoří druhý posel. Ireversibilní. • Obecnou cestou přenosu informace je fosforylace - kinasy. Zasaženými místy na enzymech jsou Ser, Thr a Tyr. Reversibilní. Terminace přenosu informace – proteinfosfatasy.

3. Princip přenosu signálu

4. The second messengers – druzí poslové uvnitř buněk.

9. Sedm transmebránových helixů – 7TM • Receptory tohoto typu přenáší signály fotonů, odorantů, chutí, hormonů a neurotransmiterů.

10. Příkladem hormonu, který se váže na sedm transmembránový receptor je adrenalin.

11. Biologické funkce zprostředkované receptory 7TM Vůně Chuť Vidění Přenos nervových vzruchů Uvolňování hormonů Chemotaxe – je pohyb vyvolaný chemikáliemi Exocytosa - proces zajišťující vylučování látek z buněk do extracelulárního prostoru. Kontrola tlaku krve Embryogeneze – vývoj zárodku (embrya) Růst a diferenciace buněk Virální infekce Karcinogeneze

12. Schematický obrázek transmembránového 7TM

13. Třírozměrná struktura rhodopsinu (7TM receptoru).

14. Rhodopsin – (opsin + retinal) a navazující heterotrimerní G-protein.

16. Změna struktury 11-cis-retinalu působením světla.

17. Schéma přenosu signálu přes receptor a G- proteiny (čich).

18. Heterotrimerní G protein

19. Konformační změny Ga po výměně nukleotidů. Aby mohlo dojít k výměně nukleotidů dochází vlivem vstupu signálu na receptor přes 7TM ke třem konformačním změnám (změna, přepnutí).

20. Conceptual insights – Signál – přenos • E:\MREG2010\Biochemistry, 6e - Content.mht

21. Rodiny G-proteinů (heterotrimerů) a jejich funkce Gasb-Adrenergní aminy, Stimulují glukagon, parathyreoidní hormon, adenylátcyklasu mnoho dalších Gai Acetylcholin, a-adrenergní aminy, Inhibují mnoho neurotransmiterů adenylátcyklasu Gat Fotony Stimulují cGMP fosfodiesterasy Ga13 Thrombin, další agonisté Stimulují Na+ a H+ výměnu Gaq Acetylcholin, a-adrenergní aminy, Zvyšují IP3 a mnohé neurotransmitery intracelulární [Ca2+]

22. Adrenergní • Adrenergní – nerv, buňka nebo buněčný receptor (adrenoreceptor) aktivovaný adrenalinem nebo noradrenalinem a analogickými látkami. • Všechny adrenergní receptory se běžně dělí na  • a-adrenoreceptory a b-adrenoreceptory • Receptory skupiny a jsou citlivější k adrenalinu než k izoproterenolu, b-adrenoreceptory reagují přesně naopak. V těle se v typickém případě váže noradrenalin spíše na a-adrenoreceptory, zatímco adrenalin na adrenoreceptory skupiny b; existuje však mnoho výjimek. Rozlišují se ještě a1 a a2 adrenoreceptory, stejně tak β1 a β2 adrenoreceptory. • Funkce adrenergních receptorů jsou velmi různé a liší se podle konkrétního typu adrenergního receptoru. • a-Adrenoreceptory: zvýšená glykogenolýza v játrech , zvýšená  glukoneogeneze, relaxace hladkého svalstva ve střevech. • b-Adrenoreceptory : zvýšená svalová glykogenolýza a jaterní glukoneogeneze a glykogenolýza, mobilizace zásobního tuku, zrychlení srdeční frekvence a prohloubení srdečních stahů.

23. Isoprotenerol, isoprenalin (vlevo), adrenalin (vpravo). Sympatomimetikum betaadrenergní agonista – shodný efekt s adrenalinem. Využívá se při zástavách srdce, astmatických záchvatech apod. β1 agonist: stimuluje aktivitu adenylátcyklasy; otevírá Ca2+ kanálky. (srdeční stimulátor; používá se při akutním kolapsu srdce a arytmiích)

24. Terminace signálu - obnova Ga. GTPasová aktivita hydrolyzuje GTP a Ga se znovu spojí s podjednotkami b a g.

25. Terminace signálu (např. adrenalin). A) Disociace signální molekuly z receptoru. B) Fosforylace cytoplasmatického C terminálního konce receptoru GRK kinasoua následná vazba b-arrestinu.

26. Arrestin • Vypnutí signálu arrestinem. • Pevním krokem je fosforylace kinasou z řady Ser/Thr kinas zvanou G protein Coupled Receptor Kinase (GRK). • GRK fosforylace specificky připraví aktivovaný receptor pro vazbu arrestinu. • Arrestin vázaný na receptor brání dalšímu přenosu signálu cestou G proteinu. • Arrestin se také váže na jiné třídy receptorů na memebráně a na další proteiny.

27. Krystalografická struktura hovězího arrestinu – S. S-antigen; sítnicový.

28. Aktivace adenylátcykalsy Gas.A)Adenylátcyklasa je integrální membránový (12 helixů) protein. Katalyticky aktivní jsou dvě intracelulární domény. B) Gas s navázaným GTP se váže na katalytickou část cyklasy a stimuluje její aktivaci.

29. Cyklický AMP • V eukaryotních buňkách aktivuje proteinkinasu A (PKA). • PKA je složena ze dvou regulačních a dvou katalytických řetězců. Za nepřítomnosti cAMP je komplex katalyticky inaktivní. Po vazbě cAMP na regulační řetězce je PAK aktivována – katalyzuje fosforylaci specifických Ser a Thr proteinů, které jsou takto aktivovány. • Např. aktivace štěpení glykogenu (glykogenfosforylasa a-aktivni a glykogenfosforylasa b - inaktivni) a současně inhibuje syntézu glykogenu.

30. Inhibitory fosfodiesterasy • Purinové alkaloidy – kofein, theobromin, theofylin. • Vyskytují se v kávě a čaji.

31. Fosfolipasy – A1,,A2, C a D. Působení fosfolipas A1,aA2 = fosfolipasa B. Phospholipase C - štěpí před fosfátem. Uvolňuje diacyglycerol a skupinu obsahující fosfátovou hlavičku. Fosfolipasy C hrají centrální roli při přenosu signálu tím, že uvolňují druhého posla – inositoltrifosfát.  

32. Hydrolýza fosfatidylinositolbisfosfátu (membránový lipid) fosfolipasou C vede ke tvorbě dvou druhých poslů. Např. po vazbě vasopressinu (antidiuretický hormon, ADH) na 7TM. Dva poslové: inositol-1,4,5-trifosfát (IP3) a diacylglycerol

33. Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 N-konec C-konec; nonapeptid Syntetizován v hypothalmu jako preprohormon, skladován ve váčcích zadního laloku.

34. Oxytocin - nonapeptid • Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 • Oxytocin jepeptidový hormon savců, který se syntetizuje v hypothalmickém jádrunucleusparaventricularis. • Dokrevního oběhu  je uvolňován z neurohypofýzy Uvolňuje se u žen po stimulaci prsu, dělohy a vagíny.

35. Oxytocin, od Cys ke Glycinamidu

36. Inositol 1,4,5-trisfosfát otevírá kanály a uvolňuje tak Ca2+ z intracelulárních prostor. • Působením IP3 dochází k uvolnění Ca2+ z endoplasmatického retikula, buněk hladkého svalstva a sarkoplasmatického retikula. • Zvýšená hladina Ca2+ v cytosolu vede např. ke kontrakci hladkého svalstva a štěpení glykogenu. • Jak se signál IP3 vypíná ? • IP3 se velmi rychle přeměňuje na další deriváty inositolfosfátů a na inositol (fosfatasy). Jeho délka života ve většině buněk je několik sekund. • Recyklaci IP3 inhibuje Li+ !!!

37. Metabolismus IP3: Tvorba a odbourávání fosfátových derivátů inositolu.

38. Diacylglycerol aktivuje proteinkinasu C (PKC) – ta fosforyluje mnoho cílových proteinů.

39. Metabolismus diacylglycerolu. Diacylglycerol je buď fosforylován na fosfatidát nebo hydrolyzován na glycerol a mastné kyseliny.

40. Ca2+ se specificky váže na calmodulin – malý kyselý protein o zhruba 148 AMK, (16 706D). Obsahu EF motiv !! Calmodulin (CaM) (zkratka CALciumMODULatedproteIN)

41. EF ruka.

42. CaM se účastní procesů jako je zánět, apoptosa, stahy hladkého svalstva, vnitrobuněčný pohyb, krátko- i dlouhodobá paměť, imunitní odpověď a růst nervové tkáně. CaM jako součást kinasy.

43. Vápenatý iont je univerzální cytosolární posel. Na obr. je detail vazby Ca2+ na kalmodulin.

44. Proč je Ca2+ univerzálním druhým poslem ? • 1. Vápenatý iont vytváří komplexy s řadou buněčných složek. Komplexy jsou nerozpustné. Proto je nutné udržovat hladinu Ca2+ na nízké hladině. To zajišťují transportní kanálové systémy. • U eukaryot jsou nejdůležitější Ca2+ ATPasa a Na+ - Ca2+ výměny. • Díky těmto pumpámje cytosolární koncentrace Ca2+ udržována u neexcitovaných buněk na 100 nM !! To je několika řádově nižší koncentrace ve srovnání s krví (5 mM). • 2. Vápenaté ionty se váží pevně na proteiny. Vazba na vedlejší řetězce Glu a Asp a kyslík bez náboje (karbonyly řetězce a kyslíkové atomy Asn a Gln. • Jakým způsobem lze měřit koncentraci Ca2+ v buňkách ??

45. Fluorescenční spektrum barviva vážícího vápenaté ionty (Fura-2). Měří se tak koncentrace v buňkách i v prostředí.

46. Vápenaté ionty aktivují regulační protein calmodulin, který stimuluje mnoho enzym a přenašečů. • Calmodulin je 17 kD protein (CaM), obsahujícíčtyři vazebná místa pro Ca2+. • Calmodulin je aktivován, když se intracelulární hladina Ca2+ zvedne nad 500 nM !!! • Calmodulin patří do rodiny EF-ruky proteinů. EF-ruka je vazebný motiv Ca2+. • Calmodulin s navázanými Ca2+aktivuje řadu enzymů, iontových pump a dalších cílových proteinů. • Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases neboli CaM kinases (EC2.7.11.17) jsou serin/threoninové prroteinkinasy primárně regulované komplexem Ca2+/calmodulin. 

47. Druhá skupina proteinů vážících Ca2+. • Proteiny vážící vápenaté ionty se nazývají annexiny – váží vápenaté ionty a fosfolipidy. • Do roku 2002 bylo identifikováno 160 annexinových proteinů v 65 druzích. • Kritérium pro annexiny: Váží fosfolipidy s negativním nábojem v prostředí vápenatých iontů a obsahují 70 aminokyselinovou opakující se sekvenci (annexinové opakování).

48. Dimerizace receptorů jako odezva na vstup ligandu a přenos signálu křížovou fosforylací. • Jako příklad uvedeme lidský růstový hormon. Monomerní protein, 217 aminokyselin, čtyři helixy. • Receptor je protein 638 aminokyselin – dělí se na část extracelulární (250 aminokyselin), jednoduchý helix přes membránu a intracelulární doména (350).

49. Křížová fosforylace JAKů (proteinkinasa, Janusova kinasa 2). Obě fosforylasy se navzájem fosforylují a tím se aktivují. Janusova kinasa (JAK = Just Another Kinase) je cytoplasmatická tyrosinkinasa.