ESERCITAZIONI 2008 APPLICAZIONI DI GENETICA UMANA E MOLECOLARE

1. ESERCITAZIONI 2008 APPLICAZIONI DI GENETICA UMANA E MOLECOLARE • Quantizzazione delle proteine • Applicazioni delle proteine di fusione

2. Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)

3. Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford • Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals • Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico • Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l’assorbanza a 595 nm • La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione, pertanto l’intensità del colore blu (e dunque l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante → il saggio è indipendente dal tipo di proteina

4. Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford VANTAGGI • Semplicità di preparazione del reattivo • Sviluppo del colore immediato • Stabilità del complesso • Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml) • Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni,degli agenti denaturanti come guanidina·HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti come sodio azide SVANTAGGI • Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere • La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aminoacidi basici → ciò rende difficile la scelta di uno standard • Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida

5. APPLICAZIONI DELLE PROTEINE DI FUSIONE • Saggi di Pull-Down • Doppio Ibrido • Saggi di legame

6. Pull-Down • Tecnica per verificare interazioni proteina-proteina “sospette” ESCA Proteina di fusione PREDA Proteina d’interesse (eucariotica)

7. Pull-Down • Produrre la proteine di fusione (ex: GST-proteina) • Purificare la proteina di fusione (ex: GST-Resina Glutatione) • Controllare su gel di poliacrilammide la qualità della purificazione • Preparare gli estratti cellulari eucariotici che contengono la proteina d’interesse

8. Pull-Down CONTROLLO ESPERIMENTO Esca Resina Resina GST GST X X Y Y Preda Preda J J Z Z Estratto cellulare Estratto cellulare lavaggi lavaggi X X Esca Preda Preda Resina GST Resina GST Z Z

9. Pull-DownVerifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot WESTERN BLOT TRASFERIMENTO SDS-PAGE WESTERN BLOT BLOCKING ANTICORPO PRIMARIO ANTICORPO SECONDARIO SVILUPPO

10. Pull-DownVerifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot MK INPUT CO ESP La nostra proteina d’interesse è stata legata dalla proteina di fusione! Il controllo è pulito

11. Pull-Down LIMITI DEL SAGGIO: • Necessità di controlli negativi, presenza di legami aspecifici alla resina. • Interazioni deboli o transienti potrebbero non essere rilevate. • La presenza del tag potrebbe interferire con il legame. • E’ un sistema forzato che potrebbe non rispecchiare l’effettiva situazione biologica.

12. Sistema del Doppio Ibrido Con questa tecnica è possibile individuare interazioni proteina-proteina. Si basa sulla proprietà dei fattori di trascrizione di essere organizzati funzionalmente in domini distinti 1)Il dominio legante il DNA (DBD) 2)Il dominio di transattivazione (AD)

13. Sistema del Doppio Ibrido I domini proteici sono normalmente identificati a classificati in base alle loro caratteristiche strutturali, funzionali e legate all’evoluzione. Un dominio può quindi essere descritto come un’unità strutturale foldata, compatta e autonoma, conservata durante l’evoluzione e in grado di funzionare indipendentemente dal contesto a cui appartiene la proteina.

14. Sistema del Doppio Ibrido Sperimentalmente è quindi possibile scindere due domini di una proteina che singolarmente non funzionerebbero, e fare in modo che riaquistino la loro funzionalità “rincontrandosi”. AD DB AD DB AD DB AD DB

15. Gal4 Sistema del Doppio Ibrido Tra i fattori di trascrizione più utilizzati c’è GAL4, che legando il promotore di Lacz permette la trascrizione della β-galattosidasi. Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in grado di scinderla e le colonie che hanno integrato il plasmide si colorano di blu. β-galattosidasi X-Gal UAS Lacz

16. Sistema del Doppio Ibrido Creazione di due ibridi: • DBD Hybrid: costituito dal dominio DBD fuso alla proteina d’interesse (Esca). Questa proteina di fusione può legare il DNA, ma non è in grado di attivare la trascrizione. • AD Hybrid: costituito dal dominio AD fuso ad un’altra proteina (Preda). Normalmente viene utilizzata una libreria di DNA.

17. Sistema del Doppio Ibrido

18. Peptide Microarray

19. High signal intensity Low signal intensity Positive data set Negative data set Peptide Microarray