Emergence de souches virulentes et/ou résistantes aux antibiotiques

1. Emergence de souches virulentes et/ou résistantes aux antibiotiques • Met en évidence l’adaptabilité des bactéries et leur capacité à évoluer très rapidement. • Plusieurs routes d’évolution des génomes bactériens : • mutations dans des gènes existants • perte ou réarrangement de l’ADN (recombinaison) • transferts horizontaux de gène(s) d’une bactérie à une autre • La pression de sélection exercée par les conditions environnementales va favoriser la survie des cellules possédant des gènes avantageux. La vitesse de croissance et de division des bactéries et leur reproduction non sexuée permettent une fixation rapide d’un allèle dans une population. • L’adaptation par le biais de mutations est un processus lent, par contre les transferts horizontaux de gènes permettent à une bactérie de s’adapter rapidement à une nouvelle niche. • Séquençage des génomes : • Disponibilité de la séquence de plusieurs souches pour une même espèce bactérienne • Génomique comparative : • Examen de la variation génétique entre souches à l’échelle génomique permet d’aborder l’analyse des changements évolutifs apparus dans des bactéries très proches.

2. Exemple : Staphylococcus aureus • Bactérie causant un important problème de santé publique du à l’apparition de nouvelles formes de virulence et de résistance aux antibiotiques. • Cause majeure d’infections acquises à l’hôpital conduisant aux décès de 2% des patients admis. • En Europe, aux Etats-Unis et au Japon, 40 à 60% des souches de S. aureus sont résistantes à la méthicilline. • Première souche méthicilline résistante (MRSA) décrite dans les années 1960, mais ce n’est qu’à partir des années 1980-90 que l’on a observé une rapide propagation des MRSA. Aujourd’hui, elles sont endémiques dans les hôpitaux et ne peuvent pas être éradiquées. • Les infections par des MRSA sont traitées avec la vancomycine mais des isolats résistants à la vancomycine (VRSA) ont été découverts récemment. • Bien que le taux d’infection par S. aureus soit plus faible à l’extérieur de l’hôpital, il y a un problème d’émergence de souches acquises par des communautés conduisant à des infections sévères. Ces nouvelles souches sont associées à une toxine appelée Panton-Valentine leucocidine (une toxine à deux composants de la membrane des staphylocoques ciblant les leucocytes) et certaines sont également résistantes à la méthicilline. • Actuellement, 6 séquences de génomes complets de différentes souches de S. aureus sont disponibles provenant de différents isolats cliniques et présentant des résistances différentes aux antibiotiques. • Analyse comparative du contenu de leurs génomes

3. Les souches séquencées de S. aureus • N315 : MRSA acquise à l’hôpital isolée en 1982 • Mu50 : MRSA acquise à l’hôpital et vanomycine résistante isolée en 1997 • Mw2 : MRSA acquise par une communauté. Elle a causé une septicémie fatale à une petite fille de 16 mois dans le Nord Dakota (USA) en 1998 • MRSA252 : MRSA acquise à l’hôpital isolée en 1997, un des clones majeurs trouvés aux USA et représentant d’un groupe causant 50% des infectons en Grande-Bretagne. • MSSA476 : MRSA acquise par une communauté isolée en 1998 à partir d’un jeune garçon de 9 ans. • COL : MRSA isolée dans les années 1960 • La taille des génomes séquencés varie de 2813 à 2903 Mb et est constitué d’un seul chromosome circulaire, parfois accompagné d’un plasmide. • La structure générale des chromosomes des différentes souches est bien conservés, avec la majorité des gènes présentant un pourcentage élevé d’identité (> 97%) et organisés dans le même ordre. Ces régions conservées sont interrompues par de petites régions présentant des différences entre les génomes.

4. Comparaison des séquences de deux souches de S. aureus avec des séquences de bactéries apparentées (extrait de Lindsay et al., (2006) Funct Integr Genomics)

5. (extrait de Lindsay et al., (2006) Funct Integr Genomics) Comparaison des six séquences chromosomiques des souches de S. aureus • Deux composants majeurs : • le génome cœur présent dans tous les isolats • le génome accessoire unique ou partagé par un petit nombre de souches

6. Le génome accessoire • Il comprend : • des prophages • des plasmides intégrés • des transposons • des îlots de pathogénie (SaPIs, S. aureus pathogenicity islands) • des cassettes (SCC Staphylococcal cassette chromosome) • des îlots génomiques • Il contient des gènes codant pour une grande diversité de fonctions non essentielles, allant de la virulence, la résistance aux drogues et métaux à l’utilisation de substrats et métabolismes variés. • Une grande partie des régions constituant le génome accessoire sont des éléments mobiles pouvant se transférer horizontalement entre bactéries. • Observation intéressante : • les gènes de virulences sont plutôt rencontrés dans les phages et les SaPIs • les gènes de résistances sont plutôt portés par les SCCs, les plasmides et les transposons

7. Bactériophages • Le transfert horizontal de facteurs de virulence par les bactériophages : • transfert et intégration d’un bactériophage dont le génome code pour un gène de virulence • transduction généralisée • Intégration de phages dans le génome de S. aureus semble courante (de 1 à 3 prophages par souches). • Les génomes des phages de S. aureus contiennent un gène codant pour une intégrase et certains possèdent un gène codant pour une excisionase. • Les phages apparaissent s’intégrer à un site unique (spécificité de l’intégrase et des jonctions droite et gauche du phage). Au moins deux sites d’intégration sont localisés dans des gènes de virulence connus : la b-hémolysine (hlb) et la lipase (geh), donc perte de ces produits. • Transduction généralisée : seul mécanisme de transfert horizontal pour plusieurs éléments génétiques mobiles non phagiques. Un seul phage de ce type, F11, a été bien étudié mais comment il « embarque » 45 Kb d’ADN bactérien n’est pas clair.

8. Îlots de pathogénie • Les SaPIs sont transférés horizontalement en présence d’un phage « helper ». Elles ont une taille d’environ 15 Kb, codent pour une intégrase et ont aussi une région promotrice de l’intégrase similaires aux intégrases de phages. Il s’intégre également de façon site-spécifique. Cependant, il ne code pas pour les autres gènes impliqués dans le processus de transfert. • Les SaPIs codent pour des gènes de toxines : • tst, toxic shock syndrome toxin-1 • seb,sec enterotoxine B et C • superantigènes ainsi appelés car ils provoquent une réponse non-spécifique des cellules T.

9. Les îlots génomiques Ces îlots sont supposés acquis par transfert horizontal, mais l’origine et le mode de transfert restent à éclaircir. Leur composition varie entre souches mais contiennent souvent des gènes associés à la pathogénie (gènes codant pour des toxines, des lipoprotéines, des sérine protéases…)

10. Eléments génétiques mobiles associés à la virulence rencontrés dans les six souches séquencées de S. aureus (extrait de Lindsay et al., (2006) Funct Integr Genomics)

11. Cassettes chromosomiques • s’insèrent toujours dans une région spécifique du génome de S. aureus à environ 25 Kb de ori • codent souvent pour des éléments de résistance aux antibiotiques comme l’opéron mec (résistance à la méthicilline) ou l’opéron far (résistance à l’acide fusidic). Cinq versions différentes de l’opérons mec (SCCmec types I à V) ont été trouvées dans les génomes de S. aureus, trois étant trouvées dans les souches séquencées • contiennent fréquemment des transposons ou des plasmides intégrés portant d’autres résistances comme les gènes de résistance à la kanamycine et à l’érythromycine • les cassettes varient en taille et ressemblent à une structure mosaïque d’intégration et de recombinaison. Elles portent un gène (ccrC) ou deux gènes (ccrA et ccrB) codant pour des recombinases site spécifique qui catalysent l’excision et l’intégration de version circulaire des cassettes. • le mécanisme permettant le transfert horizontal des cassettes n’est pas très bien compris car leur taille est trop grande pour être contenue dans la tête d’un phage (transduction généralisée). D’où peut être la faible fréquence de dispersion des cassettes, SCCmec de type IV faisant exception, ceci étant peut être du à sa plus petite taille

12. Les plasmides • 3 classes de plasmides dans S. aureus : • plasmides de classe I, d’une taille en général inférieure à 5 Kb, probablement transférés par transduction généralisée. Ils sont les plus petits et trouvés en grand nombre de copies. Ils codent pour seulement un ou deux gènes de résistance aux antibiotiques (pT181 trouvé dans la souche COL code pour la résistance à la tétracycline). Certains peuvent s’intégrer dans le génome. Par exemple, pUB110, portant des résistance à la kanamycine et bléomycine, est trouvé intégré dans la cassette SSCmec type II, dans trois des souches séquencées. • plasmides de classe II, d’une taille pouvant atteindre 40 Kb, portent des résistance à un ou plusieurs b-lactames (bla), aux métaux lourds (ars, cad, mer), aux antiseptiques (qac), aux aminoglycosides (aacA-aphD). Ces opérons sont souvent portés par des transposons qui se sont intégrés dans le plasmide. Ces plasmides seraient probablement transférés par transduction généralisée. • plasmides de classe III, similaires aux plasmides de classe II mais codent pour des gènes permettant un transfert conjugatif. Ils peuvent atteindre une taille de 60 Kb.

13. Les transposons Ils codent pour des gènes de résistance et sont souvent intégrés soit dans des cassettes, soit dans des plasmides. Par exemple, la souche de S. aureus résistante à la vancomycine a maintenant été décrite. Le gène de résistance vanA est codé par un transposon dérivés des enterococci. Le mécanisme de transfert probable est que le transposon « saute » sur un plasmide conjugatif de réponse aux phéromones, qui se serait transféré par conjugaison dans S. aureus. Le plasmide est incapable de se répliquer dans S. aureus, mais le transposon a eu l’opportunité de « sauter » dans le génome de S. aureus ou dans celui d’un plasmide de S. aureus.

14. (extrait de Lindsay et al., (2006) Funct Integr Genomics) Eléments génétiques mobiles associés à la résistance aux antibiotiques rencontrés dans les six souches séquencées de S. aureus

15. Six génomes est-ce suffisant ? Le choix des souches séquencées est souvent dicté par des raisons biologiques ou politiques (ex souches causant des épidémies, souches de laboratoire etc…). Cependant, ces souches peuvent ne pas être caractéristiques de l’espèce entière. Quelle part de la population de S. aureus représentent les six souches séquencées. Utilisant MLST, il est possible d’étudier les relations phylogénétiques de 334 isolats. 87% de ces isolats appartiennent à 11 complexes clonaux (CC). Les six souches séquencées se répartissent dans 4 de ces CC. Donc pour avoir une bonne représentation du génome de S. aureus, il faudrait choisir les futures souches à séquencer dans les 7 autres CC et dans celles n’appartenant pas à un complexe clonal.

16. (extrait de Lindsay et al., (2006) Funct Integr Genomics)