Hooke, Micrographia (1664) Mikeladze-Davi et al , Cell ( 2005)

1. Microscopía (2011) Hooke, Micrographia(1664) Mikeladze-Davi et al, Cell (2005) Lic. Juan Burdisso

2. EVOLUCION DE LOS MICROSCOPIOS OPTICOS Carl Zeiss 1857 STED Microscopy http://micro.magnet.fsu.edu/ http://www.zeiss.com/micro

4. Tipos de Microscopia Microscopía de campo claro (coloreado). Contraste de fase. Microscopía de contraste de interferencia (DIC). Microscopía de epifluorescencia. Microscopía de Fuerza Atómica (AFM). Microscopia de fluorescencia de refección interna total (TIRFM). STED Microscopy

5. Partes de un Microscopio Óptico de Epifluorescencia (Nikon Eclipse 600) http://www.microscopyu.com

6. Fuente : lámpara de mercurio Célula epitelial, triple coloración: núcleo (azul), microtubulos (verdes), actina (rojo). 1000X 

7. Entonces las partes fundamentales de un microscopio de epifluorescencia son…. * Cubos * Objetivos * Cámara (chip CCD) "Charge Coupled Device" Estos componentes hacen la diferencia en este tipo de microscopia

8. CUBO 1 (para observar GFP; Alexa 488; etc) first barrier filter (Excitación) 465-495 nm (Blue light) beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑505 nm second barrier filter (Emisión) 515-555 nm (Green light) CUBO 2 (para observar mRFP; DsRED; Alexa 546; Alexa 546; etc) first barrier filter (Excitación) 528-553 nm (Green light) beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑565 nm second barrier filter (Emisión) 600-660 nm (Red light) CUBO 3 (para observar DAPI; Hoechst;etc) first barrier filter (Excitación) 330-380 nm (Violet light) beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑400 nm second barrier filter (Emisión) 435-485 nm (Blue light)

9. RECORDEMOS: Espectros de Absorsión o Excitación y de emisión La intensidad de fluorescencia emitida varía con la longitud (l) de excitación. La exitación a la lmax (A), produce la fluorescencia más intensa (A). La distribución del espectro no depende de la l de exitación. Las moléculas fluorescentes absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra longitud de onda mayor (corriemiento de Stokes).

10. Objetivos de microscopía óptica

11. Apertura Numérica (AN) = n X sen  n= índice de refracción n aire: 1 n agua: 1.3 n aceite/vidrio: 1.5 Limite de Resolución = 0,61 X λ AN Intensidad= (Apertura Numérica)4 (Magnificación)2 Objetivos 10X NA=0.25 → R= 1.34 µm 20X NA=0.40 → R= 840 nm 40X NA=0.65 → R= 520 nm 60X NA=0.80 → R= 420 nm 100X (oil) NA=1.25 → R= 270 nm

12. Cámara (Chip CCD) La resolución de una cámara depende del tamaño y numero de pixeles del chip. chip: 1360 x 1024 pixels El Binning(reagrupación de pixeles para formar un superpixel) B: 0 B: 2x2 B: 4x4 Que ganamos: Sensibilidad (util en muestras poco fluorescentes, para estudios in vivo). Que perdemos: Resolución (la imagen esta mas pixelada).

13. Detectores electrónicos de luz (pixeles del chip CCD) Constan de una superficie fotosensible que captura los fotones incidentes y genera cargas electrónicas que son sensadas y amplificadas.

14. Debe existir una relación entre la resolución de un microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD. Nyquist Frecuency (Límite de resolución del microscopio → 2.3 pixeles en el chip). Si este principio no se cumple nuestro microscopio es casi obsoleto. función de dispersión de punto 3D (point spread function)

15. El rango dinámico: parámetro relacionado con la capacidad de captar diferencias cuantitativas entre la señal mas débil y la mas Intensa. 2 n bits 1bit= 2 niveles de grises 2 bits= 4 niveles de grises 3 bits= 8 niveles de grises 4 bits= 16 niveles de grises 8 bits= 256 niveles de grises 9 bits= 512 niveles de grises 10 bits= 1024 niveles de grises 12 bits= 4095 niveles de grises 16 bits= 65536 niveles de grises Fotones→ → →Electrones→ → → → → Bits Fluorescencia → Pixeles del chip CCD → Digitización

16. Tipos de Microscopia

17. Total Internal Reflection Fluorescence Microscope (TIRFM) In cell and molecular biology, a large number of molecular events in cellular surfaces such as cell adhesion, binding of cells by hormones, secretion of neurotransmitters, and membrane dynamics have been studied with conventional fluorescence microscopes. However, fluorophores that are bound to the specimen surface and those in the surrounding medium exist in an equilibrium state. When these molecules are excited and detected with a conventional fluorescence microscope, the resulting fluorescence from those fluorophores bound to the surface is often overwhelmed by the background fluorescence due to the much larger population of non-bound molecules. The TIRFM was developed by Daniel Axelrod at the University of Michigan, Ann Arbor in the early 1980s. A TIRFM uses evanescent wave to selectively illuminate and excite fluorophores in a restricted region of the specimen immediately adjacent to the glass-water interface. The evanescent wave is generated only when the incident light is totally reflected at the glass-water interface. The evanescent electromagnetic field decays exponentially from the interface, and thus penetrates to a depth of only approximately 100 nm into the sample medium. The selective visualization of the plasma membrane renders the features and events on the plasma membrane in living cells with high axial resolution. TIRF can also be used to observe the fluorescence of a single molecule, making it an important tool of biophysics and quantitative biology.

18. Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) exploits the properties of an induced evanescentwaveor fieldin a limited specimen region immediately adjacent to the interface between two media having different refractive indices. Beyond the angle of total reflection, the electromagnetic field of the incoming/reflected light still extends into the z direction. This evanescentwaveis identical in frequency to the incident light, but it decays exponentially in intensity with distance from the interface and its effects extend only a few hundred nanometers into the second medium (having the lower refractive index).

20. Marcación: GFP-PTP 1B DA Epifluorescencia TIRFM Fotos: Lic Ana G Wusener

21. Microscopía Confocal Fuente de luz: Lasers Detectores: Tubos fotomultiplicadores Pinholes (confocalidad)

22. Microscopía Confocal Microscopía de Epifluorescencia

23. Seccionamiento óptico y recosnstrucción 3D Polen

24. STED MICROSCOPY (Stimulated Emission Depletion)

26. Microscopia STED Actin Fibers Sample Courtesy of Elise Stanley, Division of Genetics & Development,Toronto Western Research Institute (TWRI), Canada

27. Microscopia STED Keratin Filaments YFP labeled keratin filaments in SW-13 cells.Sample: courtesy of Reiner Windoffer, RWTH Aachen University, Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Aachen, Germany

28. Microscopia STED Clathrin Vesicles Distribution of Clathrin vesicles in HeLa cells.Fluorescent marker: Alexa 488, immunolabeling.

29. Microscopía de contraste de fase • Las zonas coloreadas reducen • la amplitud de ondas de luz de • determinadas longitud que pasan • a traves de ellas. B) La luz que pasa a través de una célula experimenta poco cambio en su amplitud. Sin embargo hay un cambio de fase al pasar a través de la célula y estos cambios se hacen visibles explotando los efectos de interferencia

30. Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para espécimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz. En el microscopio de fase el cono de luz entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible.

31. Microscopía de campo claro Absorción : es la disminución en la amplitud de onda cuando esta pasa a través de un objeto . La mayoría de las células muestran muy baja absorción con la luz visible. Esto resulta en la naturaleza transparente del objeto bajo la luz del microscopio, y en un contraste pobre.

32. Microscopía de campo claro (preparados coloreados) • Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados.

33. Microscopía de contraste de interferencia (DIC) Nomarski - DIC. Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases

34. Microscopía de Fuerza Atomica (AFM) El Microscopio de Fuerza Atómica (MFA) es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de los nanonewton. Al analizar una muestra, se registra continuamente la altura sobre la superficie de una sonda o punta cristalina de forma piramidal. La sonda va acoplada a un listón microscópico, muy sensible al efecto de las fuerzas, de sólo unos 200 μm de longitud. La fuerza atómica se puede detectar cuando la punta se aproxima a la superficie de la muestra. Se registra la pequeña flexión del listón mediante un haz láser reflejado en su parte posterior. Un sistema auxiliar piezoeléctrico desplaza la muestra tridimensionalmente, mientras que la punta recorre ordenadamente la superficie. Todos los movimientos son controlados por una computadora. La resolución del instrumento es de menos de 1 nm, y la pantalla de visualización permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de varios millones de veces. El microscopio de MFA, puede realizar dos tipos de medidas: imagen y fuerza. En la modalidad de imagen, la superficie es barrida en el plano de la superficie por la punta. Durante el barrido la fuerza interatómica entre los átomos de la punta y los átomos en la superficie de la muestra, provoca una flexión del listón. Esta flexión es registrada por un sensor adecuado (normalmente balanza óptica) y la señal obtenida se introduce en un circuito o lazo de realimentación. La fuerza interatómica se puede detectar cuando la punta está muy próxima a la superficie de la muestra. En medidas de fuerza la punta se hace oscilar verticalmente mientras se registra la flexión del listón. Las medidas de fuerza son útiles en estudios de fuerzas de adhesión y permiten estudiar a nivel de una sola molécula interacciones específicas entre moléculas (ej: Interacción molécula de adhesión celular- proteínas de matriz extracelular, interacción antígeno-anticuerpo, interacción entre hebras complementarias de ADN) o interacciones estructurales de las biomoléculas (plegado de proteínas) así como caracterizar la elasticidad de polímeros.

35. Microscopía de Fuerza Atomica (AFM) Tocadisco molecular

36. Microscopía de Fuerza Atomica (AFM) Moléculas de ADN

38. “FIN”