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Dehydration clearing and infiltration of tissue. Lee Ming-Wei. 石蠟包埋之步驟 固定 （ Fixation ） 脫水 （ Dehydration ） 澄清 （ Clearing ） 浸潤 （ Infiltration ） 包埋 （ Embedding ） 切片 （ Sectioning ）. 脫水 (dehydration). 由已固定之組織除去水份之過程
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Dehydration clearing and infiltration of tissue Lee Ming-Wei
石蠟包埋之步驟 • 固定（Fixation） • 脫水（Dehydration） • 澄清（Clearing） • 浸潤（Infiltration） • 包埋（Embedding） • 切片（Sectioning）
脫水(dehydration) • 由已固定之組織除去水份之過程 • 製作石蠟切片，切片前須將石蠟渗透組織包埋於石蠟中，而水與石蠟又是不相混合的，所以在浸蠟，包埋前必須將組織内所含的水分脱去。 • 大多數的組織固定劑是水溶液，随後的水冲洗也使其含有大量水分，因此必須先行脱水，一般是浸入逐级增加濃度的酒精來完成。 • 由於酒精和石蠟不能混合，須再用一種石蠟的溶劑來置換酒精，因大多數石蠟溶劑有使組織的折光率增高並表現為透明或半透明狀，所以此步驟又稱透明。
一．常用的脱水劑 酒精 • 酒精：是最常用的脫水試劑，可與水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比較强，又能硬化組織。但是酒精對於組織會有明顯的收縮作用。因此在以酒精作為脱水劑時，應該先以濃度較低的酒精開始，然後遞增其濃度，這樣可以避免組織過度收縮。 • 第一瓶酒精濃度随固定劑，脱水組織的大小和種類而異，經水溶性固定劑固定的細柔組織需要慢慢脱水，以50％酒精開始。 • 如眼球，胚胎組織等大多數組織標本則是以70％酒精開始，再經80％，95％以至無水酒精。
但是有時為了某種特殊要求，例如要做糖元的切片標本或是要做尿酸结晶染色切片標本，為了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入無水酒精中固定，而不需要經過水洗和低濃度酒精的脱水過程。經無水酒精固定後的組織只需要再經過换一次無水酒精脱水即可。但是有時為了某種特殊要求，例如要做糖元的切片標本或是要做尿酸结晶染色切片標本，為了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入無水酒精中固定，而不需要經過水洗和低濃度酒精的脱水過程。經無水酒精固定後的組織只需要再經過换一次無水酒精脱水即可。 • 用AF固定液固定的組織可直接置于95％酒精開始脱水。用醇性固定剂（如Carnoy）則可置於高濃度無水酒精内，但應多次换液以除酸。
一般情况下，組織經過70％，80％，90％，95％，以至無水酒精的脱水程序，即可達到脱水的要求。但是為了能使大量的組織塊同時進行脱水，則要求保持液體的濃度以保証脱水的作用，最好是以兩次95％酒精，兩次100％酒精重複進行脱水，以保証組織的水分脱净。脱水時間應視組織種類，組織塊大小，厚薄和固定劑的不同而異。如脱鈣的骨組織，實質性臟器等的脱水過程宜短，而疏鬆結締組織，脂肪組織等，脱水過程則宜適當延長。水分必須脱乾淨，脂肪必須溶去。含有鉻酸的固定劑固定的組織，脱水時間不宜過長，而鍍銀組織更應注意，脱水時間應比沒有鍍銀的同類組織要短。一般情况下，組織經過70％，80％，90％，95％，以至無水酒精的脱水程序，即可達到脱水的要求。但是為了能使大量的組織塊同時進行脱水，則要求保持液體的濃度以保証脱水的作用，最好是以兩次95％酒精，兩次100％酒精重複進行脱水，以保証組織的水分脱净。脱水時間應視組織種類，組織塊大小，厚薄和固定劑的不同而異。如脱鈣的骨組織，實質性臟器等的脱水過程宜短，而疏鬆結締組織，脂肪組織等，脱水過程則宜適當延長。水分必須脱乾淨，脂肪必須溶去。含有鉻酸的固定劑固定的組織，脱水時間不宜過長，而鍍銀組織更應注意，脱水時間應比沒有鍍銀的同類組織要短。
(補充) • 在常規HE染色中雖然可觀察到神經元及神經纖維的全貌，但是細微的結構和某些特殊成分還需用特殊的染色方法來顯示。 • 神經元和神經纖維的染色法較多，但主要為鍍銀法。鍍銀法的基本原理是把固定後的組織或切片浸於銀溶液中，再用還原劑處理，使銀顆粒沉著于軸索的軸漿中，使之呈現深棕色或黑色。鍍銀後可在神經元胞漿內看到許多交錯成網的細絲，並伸入樹突及軸突之中。 Nerve fiber stain
脱水的基本原則：以低濃度酒精開始逐漸升到高濃度酒精，以保持組織中的水分完全脱净。一般1cm x 1cm x 0.2cm大小的組織,脱水全過程只需要數小時即可達到完全脱水。如果組織脱水不完全,隨後的透明,浸蠟都會受到影響,致使切片很難以完成。較差質量的切片,很容易造成在染色時脱片,這樣的組織蠟塊，因其含有一定的水分,一經與空氣接觸即乾燥而凹陷。 • 酒精脱水劑使用不宜太久,應適度更换新液。當酒精混濁,變黄或酒精滴於水中出現乳白色混濁時,表示酒精中溶解了過量的脂類,這種情形一出現,將會影響脱水,則應即時更換。
各種濃度酒精的配製：切片室内應常備有70%,80%,85%等各種濃度的酒精。配製時應以95%酒精作為基液加水稀釋,不要用無水酒精去配製,因無水酒精的價格較高,極不經濟。配製方法如下：各種濃度酒精的配製：切片室内應常備有70%,80%,85%等各種濃度的酒精。配製時應以95%酒精作為基液加水稀釋,不要用無水酒精去配製,因無水酒精的價格較高,極不經濟。配製方法如下：
95-50＝45 • Alcohol: water=50：45 • 2×50/95
2.丙酮(Acetone)：可用作固定液,也是一種比較好的脱水劑。脱水能力强、速度快,可配製不同濃度進行脱水。但一般情况下,多用在無水酒精的補充脱水。丙酮脱水時間比酒精短,但容易使組織過度硬化,所以應適當掌握脱水時間。若需緊急處理則可每次20分鐘以4次丙酮處理以作為包埋之脫水。 健康危害效應：輕微中樞神經抑制劑，高濃度蒸氣可能引起頭痛、噁心、頭暈、嗜睡、動作不協調和精神混淆、刺激眼睛、吞食或嘔吐時可能倒吸入肺部。
3.正丁醇(γ-Buty alcohol)：正丁醇脱水能力較酒精弱,可與水、酒精相混合,而且也能溶解石蠟,因此正丁醇不但可以替代酒精使組織脱水,還可以代替二甲苯使組織透明。平常在稀釋時都與酒精按照一定比例配製使用,或把組織脱水至90%酒精後移入正丁醇, 正丁醇再脱水後可直接投入石蠟。用正丁醇脱水,組織比較少引起收縮和硬化等不良结果。 最重要症狀及危害效應：為中樞神經抑制劑，會導致類似酒精中毒的效應 對急救人員之防護：戴防護手套，以免接觸污染物。 對醫師之提示：吞食時，考慮洗胃、通便。
4.二氧乙環(Dioxan)：二氧乙環是一種有毒物質,易揮發（沸點34℃）(使用場所必須通風),能同水、酒精、二甲苯相混合並能溶解石蠟,是一種既可以脱水,也具有透明效果的液體。脱水一般可以70%開始,再經過90%至純二氧乙環,然後浸入石蠟。二氧乙環脱水對組織無收縮和硬化等不良現象,對易收縮的組織可使用二氧乙環。 急毒性： 吸入：1 . 可能造成刺激、咳嗽、頭痛、噁心、嘔吐、疲倦、失去平衡、胃痛、食慾減退。2. 造成肝、腎、肺、腦之傷害， 昏迷或死亡。 眼睛： 刺激眼睛及流淚。 皮膚： 會造成微刺激感。 食入： 可能造成噁心、嘔吐、腹瀉及腎、肝之傷害。
5.Cellosolve(2-Butoxyethanol、2-丁氧基乙醇 ) Cellosolve Cethylene glycol monoethyl ether能快速脫水對組織無不良影響。組織可由水或生理鹽水直接放入 Cellosolve。此脫水過程會有四槽：30分鐘、30~60分鐘、60分鐘與90分鐘。組織必須以對二甲苯澄清後再置入於三次之石蠟內，每次ㄧ小時。組織可保存於Cellosolve內幾個月不變形。 吸入：1.為中樞神經系統的抑制劑。2.高濃度會造成鼻、喉的刺激感、頭痛、暈眩、昏昏欲睡、精神錯亂及意識不清(100ppm以下不太可能產生上述症狀) 。3.毒性約為乙醇的1.5 倍。皮膚接觸：1.直接接觸會引起輕微的水腫及發紅。2.有引起過敏之病例。 眼睛接觸： 液體可能造成刺激感， 高濃度的蒸氣亦具刺激性。食入：1.大量食入可能引起類似吸入的症狀。2.若吸入肺部會造成嚴重的肺傷害( 水腫)， 可能使呼吸心跳停止及死亡。
6.Triethyl phosphate（亞磷酸三甲酯 ） Triethyl phosphate 可使用於石蠟包埋，組織經固定、沖洗後可直接置入Triethyl phosphate 內脫水(24小時內固定三次) 。其可快速取代水份且只產生及小之。變形 急毒性、嚴重刺激皮膚、肺部及眼睛。也對肝、腎有損傷
7.Tetrahydrofuran 四氫呋喃可同時脫水與澄清組織，因其可與水及石蠟混合。此外亦可與低濃度乙醇、水、乙醚、氯仿、丙酮、苯、二甲苯混合。其性質上與用法上與dioxane極相似。此試液之味道較刺激而會使操作人員產生角膜炎，因此必須於通風之房間使用。 抑止中樞神經系統
二.組織的搖震為加快脱水過程可把標本放入各級酒精内借助機器或手工震摇，還可以加温促進脱水。即把標本裝在塞緊的玻璃瓶置於包埋箱或温箱内，因液體受熱產生的正壓可增加溶液的對流。但熱酒精會使組織過硬，並有爆裂危險，除急診外，最好不用此方法。 二.組織的搖震為加快脱水過程可把標本放入各級酒精内借助機器或手工震摇，還可以加温促進脱水。即把標本裝在塞緊的玻璃瓶置於包埋箱或温箱内，因液體受熱產生的正壓可增加溶液的對流。但熱酒精會使組織過硬，並有爆裂危險，除急診外，最好不用此方法。
一、人工組織脱水法 該法經濟實惠，靈活度高，可根據不同的組織及其大小來確定脱水時間，也可根據不同組織及大小分批進行脱水，其優點是： • 可根據不同的組織及大小，任意增减脱水時間，達到脱水目的。 • 可随時觀察組織的變化，隨時中斷組織的脱水，不使組織過度硬脆。 • 可以多層次地進行脱水。 • 缺點 • 需耗费人力，每個步驟的遞增都需要人工完成。 • 不能大量的進行脱水。 • 必須在上班完成脱水或者定點於於某一濃度的酒精中過夜，晚上無法進行梯度遞增。
二、自動組織脫水機脫水 自動組織脱水機的機型品種類繁多，大小不一，有軌道式、圓盤式等 主要技術參數 液缸數量：12個液缸（最後3個蠟缸 處理時間：1～9分別在0～24小時內任意設定 10～12缸分別在0～24小時內任意設定 溫度控制：室溫～96小時（四天）內任意設定 起缸停留時間： 20秒～120秒 組織保護缸位：第七缸（保護溶液） 單缸容積：通用型1000mL大容量型2000mL 電 源：AC220V±10% 50HZ±1HZ 環境溫度：0～40℃
工作特性： ● 溶缸數量：12只，其中有溶劑缸9只，蠟缸3只 ● 單缸容積：110×110（mm）3 ● 單缸浸留時間：10分鐘-24小時内按需要選擇● 蠟缸温度：室温~75℃可調，水浴加熱，自動恒温 ● 吊藍規格：吊籃90×80（mm） ● 電源：220V±10%。50HZ±2%，≤500VA ● 工作環境：5℃-40℃ ● 體積：780×780×1100（mm）3；720 mm× 600 mm（J型）
脱水機脱水的優點有： • 組織脱水均匀； • 能在無人在的情况下完成組織的梯度遞增，完成脱水，透明和浸蠟蜡程序，如此可節省人力物力。 • 能大量地處理標本。 • 脱水機脱水存在的不足：(1).由於機器的原因，在脱水時，大小組織一起，造成小組織過度處理而產生硬脆的現象，使之難以切成佳片。(2).如為掀蓋式的脱水機，液體容易揮發，污染環境，影響工作環境。
透 明 （澄清）組織脱水後後，還要經過一個浸蠟的媒劑透明過程。目的是使石蠟渗透到組織中去，達到包埋的支持作用。常用的脱水剂如酒精等，不能溶解石蠟與之相混合，因此必須使用一種既可以同酒精又能同石蠟相混合的媒劑，當組織脱水後，浸蠟之前把組織投入這種媒劑中。由於兩劑能相混合，另一方面也由於這種媒劑比酒精比重大，組織中的酒精就被該媒劑取代，待酒精完全被該媒劑完全取代後，組織即成透明狀態，因此我們稱這種媒劑為透明劑，在製片中的這一過程就稱為透明。實質上透明祇是一種過程而非目的，其所以出現透明現象是因為折光係數改變的缘故。以組織的狀態上看，由於組織經過媒劑的作用之後，其折射係數近於組織蛋白的折射係數，因而顯示出透明狀態。組織一旦呈現透明狀態，也說明脱水劑已被媒劑所取代。透明後就可以把組織浸入溶解的石蠟進行浸蠟。
透明劑很多，一般常用的有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，香柏油等。 1．二甲苯（xylene）：是最為常用的一種透明劑，它能與酒精，丙酮相混合，又是石蠟的溶劑。在透明過程中，組織繼續發生硬化，由於二甲苯對組織的收縮性强，作用迅速，因此，組織在二甲苯中時間不宜過長，否則組織容易變脆變硬，一般是達到組織的透明為適度，小塊組織在半至一小時内透明。為了不使組織過度硬化，苯則是是更好的一種透明劑，它較甲苯和二甲苯的作用稍缓，對組織收縮較少，不易變脆。但苯較二甲苯毒性大，揮發快，故應注意安全使用。 • 在一般的情况下，胃、腸粘膜透明時間5-10分鐘，鼻咽部及排出物為15-20分鐘左右，子宫肌瘤、平滑肌組織為60-120 分鐘。總之組織的透明，應視組織的大小而定，不能千篇一律
二甲苯及苯類物質被認為是一種致癌性的物質，許多單位和個人都不敢用或盡量少用，或者在切片染色至酒精後，將之吹乾就進行封片，這種做法是非常糟糕的，以往切片的整個製作程序都强調不要使切片乾涸，上述做法將會影響切片颜色的保存。其它的透明，由於作用較為緩慢，不適應於臨床檢體，但爲了某些研究，也可以使用一些缓慢性的透明劑，如此效果較好。二甲苯及苯類物質被認為是一種致癌性的物質，許多單位和個人都不敢用或盡量少用，或者在切片染色至酒精後，將之吹乾就進行封片，這種做法是非常糟糕的，以往切片的整個製作程序都强調不要使切片乾涸，上述做法將會影響切片颜色的保存。其它的透明，由於作用較為緩慢，不適應於臨床檢體，但爲了某些研究，也可以使用一些缓慢性的透明劑，如此效果較好。 急性：蒸氣會刺激眼睛，黏膜和皮膚；高濃度會引起麻醉。 吸入：短暫的暴露於200ppm濃度，會刺激鼻和喉嚨。暴露於700ppm的濃度，會引起噁心和嘔吐。 暴露於高濃度大約(10000ppm)，會引起動作不協調、失去意識、呼吸衰竭甚至死亡。暴露於高濃度會引起肝臟和腎臟損害。皮膚：液體會刺激眼睛引起紅斑、乾燥和脫脂，長期接觸會引起皮膚炎。蒸氣會刺激皮膚。眼睛：1.其蒸氣和液體會刺激眼睛。慢性：反覆或長期暴露可能引起皮膚炎(乾燥、龜裂)。肝臟和腎臟損害。 O-xylene
2氯仿：也是一種很好的媒劑，它的作用缓和。組織在此液内過夜也不至於過硬變脆，這一點較苯，二甲苯和甲苯優良。但氯仿比重較大，折光率較小，不能改變組織的折光率，組織在氯仿中不易呈現二甲苯那樣的透明現象，所以組織要比實際需要浸渍更長一些時間保證完全渗透和置換出酒精。 健康危害效應 急性：吸 入：吸入高濃度時，可能引起麻醉昏迷、休克，並且有致命危險。主要影響中樞神經系統、心臟、肝和腎。皮膚接觸：皮膚吸收部位會產生如充血、紅斑及水分喪失的刺激反應，有灼傷危險。眼睛接觸：具刺激性，有灼傷危險。 食 入：引起口腔和喉嚨嚴重灼傷，腹部及胸部疼痛、吐嘔及失去知覺。慢性：可引起心臟、肝臟、腎臟及中樞神經系統的傷害。暴露之徵兆及症狀：刺激感、麻醉感、頭痛、困倦、嘔吐、暈眩致死。
3香柏油(杉木油 oil of Cedarwood)： 是研究處理細柔組織的最佳透明劑，因它的硬化作用極小，組織在此液體内較長時間甚至幾個月也無仿。過硬的組織脱水後，（如皮膚和致密纖維組織）用香柏油透明，經此處理後的組織容易切片。不過香柏油的濃度大，渗透力弱，同石蠟混合不及其他透明劑效果好，故常規石蠟切片一般不用。
4.甲苯(Toluene) 性質與二甲苯相似，澄清速率比二甲苯或氯仿慢，但其不使組織硬化可隔夜放置。亦為無色液體，可與石蠟完全混合。 吸入或吞食有害，造成中樞神經系統抑制，蒸氣可能引起頭痛、疲勞、暈眩、眼花、噁心、麻木、頭暈、動作不協調和精神混淆、吞食或嘔吐時可能倒吸入肺部。
5.醋酸戊酯(Amyl acetate) Amyl acetate對組織不產生硬化現象，適用於大件之組織，因其需要較長之浸潤時間，若使用其他種澄清劑可能會導致組織硬化。
6.酚-二甲苯(carbol-xylene) 酚-二甲苯(carbol-xylene＝1：3)使用於固封組織切片之前，其澄清極速而通常只使用於不易澄清之組織。切片置於此液內勿超過5~10分。經此液澄清後，切片必須於二甲苯內完全洗淨以除去殘留之酚再行固封(因其會使染色退色)
浸潤(Infiltration) • 浸 蠟組織經媒劑的透明作用之後，移入熔化的石蠟内浸漬，石蠟逐漸浸入組織間隙，取代透明劑，這一程序就叫浸蠟。根據所用石蠟的溶點，浸蠟需要能够保持於54－60℃温箱内進行。石蠟的質量和熔度與切片質量密切相關，因此對石蠟的選擇應以注意。 • 組織在脱水時，組織中的脂類和類脂等物質在脱水劑的作用下被溶解掉，留下了許多腔隙，許多管腔組織和血管，也有許多腔隙，這些都嚴重地影響了切片。組織浸蠟時，由於二甲苯（誘導劑）的作用，石蠟進入到組織的各個角落，並在各個角落中保存下來。
當石蠟包埋後冷却時，這浸入到裡面的石蠟便可起到支撑的作用，而且使組織不致於變形，塌陷等現象，使切片能完整的切出，便於鏡下觀察。當石蠟包埋後冷却時，這浸入到裡面的石蠟便可起到支撑的作用，而且使組織不致於變形，塌陷等現象，使切片能完整的切出，便於鏡下觀察。 • 用作浸蠟的石蠟不應含有顆粒，雜質及其他異物，不含水分，質地均勻成半透明狀，結晶及颗粒少。石蠟中如水分會結晶而變為白斑可用加熱攪拌的方法除去。所有的蠟在使用前按常規必須用標準濾紙在漏斗内過濾到唐磁杯裡儲存於浸蠟箱中。最好將石蠟於鍋中加熱煮至近沸，冷却再煮反覆數次後空氣可以排除，揮發性油脂類在煮的過程中揮發。處置後的石蠟置於恒温箱中保持液體狀態備用。所用的石蠟有一定的熔點和硬度，熔點高，硬度大。一般要求在52－56℃之間，既可以支持硬組織也可使切片成條。使用時應根據組織類型以及製片時的温度和氣候而異。夏季採用高熔點的石蠟，冬季則採用低熔點的石蠟。
石蠟的熔點越低，其質地相對的較微疏鬆。硬蠟（熔點60℃）用於硬纖維組織。軟蠟用於胎兒和乳腺組織，這些皆為研究工作的需要。為了增加石蠟的韌性，可在石蠟中加入一些混合劑，常用蜂蠟，硬脂酸，松香等。石蠟的熔點越低，其質地相對的較微疏鬆。硬蠟（熔點60℃）用於硬纖維組織。軟蠟用於胎兒和乳腺組織，這些皆為研究工作的需要。為了增加石蠟的韌性，可在石蠟中加入一些混合劑，常用蜂蠟，硬脂酸，松香等。 • 石蠟有軟蠟和硬蠟之分，軟蠟的熔點有45℃、52~54℃。硬蠟的熔點有56~58℃，58~60℃、60~62℃。浸蠟的順序 是先軟蠟，後硬蠟，浸蠟的時間根據組織不同而確定不同的時間。有的人指出組織浸蠟先放入二甲苯與石蠟等混合的液體中浸漬然後再放入軟蠟、硬蠟。根據使用經驗認為不必要這樣做。因為組織經二甲苯或其它透明劑透明後，在組織浸入石蠟時，自己帶著残存的透明液，如為手工操作，可將組織塊乾燥，盡量减少残存液的存在，而自動脱水機則不然 ，組織可存留一定量的透明劑，經使用次數多次後，残存的透明劑可把石蠟稀釋。因此機器程序處理的次數較多時，應注意換石蠟，以防組織浸蠟效果不好。
一、石蠟的性質 • 石蠟是一種碳氫化合物，由礦物油的分裂產生，它的性質是相當的不同，其熔點在45~62℃之間。熔點高的為硬蠟，硬度較高，適合於夏天切片的用蠟，熔點低的為軟蠟，54℃以下的稱為軟蠟，這種適合於組織化學的切片用蠟。根據石蠟的特點，根據季節的不同，合理地使用不同熔點的石蠟，這是能否切好片的關鍵。 • 二、石蠟性質的改善 為了獲得較好的連續切片，人們想出了許多種方法，對石蠟進行改造，使石蠟的硬度和柔軟性更適合於佳片的切出，提出了許多種方法：
石蠟加熱冷卻法 剛購入的石蠟,不管是動植物切片石蠟也好,還是工業用蠟也好,都必須進行處理,方法是:將石蠟放於容器裏,於電爐上加熱,此時石蠟遇熱熔解並發出嗶嗶吧吧的聲音,這是石蠟中含有的雜質,遇熱後分解所發出的聲音,隨著時間的延長,溫度的升高,這種聲音將逐漸減少,直至消失。此時可將盛裝石蠟的容器浸入冷水中，石蠟凝結後，再繼續加熱，如此反復幾次即熔化—冷卻—熔化—冷卻。這種處理方法，可增加石蠟的密度和可塑性，除去雜質。為達高品質的切片，這是必經之法。
改善石蠟的韌性和粘度 這種方法則需要加入一些東西才能獲得，如蜂蠟和硬脂肪，蜂蠟最高熔點可達70餘度，增加它可增加石蠟的硬度。石蠟切片切4—5um，60℃左右的石蠟可支撐得起，如要切1~3um，其硬度則不夠，因此，要制出較薄的切片，石蠟硬度一定要過關。另外，增加石蠟的硬度還可以加入脂蠟酸、柏油、楊梅蠟等，雖然如此，石蠟經處理後，用時的顏色如肥皂一樣為最好。在瞭解了石蠟的性質及如何改造它後，下面再瞭解組織浸蠟。
蜂蠟：又叫黃蠟，是蜜蜂用來造巢的淡黃色蠟，熔點在54℃左右，質地柔軟，滑潤有韌性。為了使低熔點的石蠟硬一些，可加入蜂蠟。它能增加蠟的熔點而不必使組織浸在高溫內，便於切片。也要根據組織的種類而異，一般常規用量不超過5％為度。蜂蠟：又叫黃蠟，是蜜蜂用來造巢的淡黃色蠟，熔點在54℃左右，質地柔軟，滑潤有韌性。為了使低熔點的石蠟硬一些，可加入蜂蠟。它能增加蠟的熔點而不必使組織浸在高溫內，便於切片。也要根據組織的種類而異，一般常規用量不超過5％為度。
硬脂酸（Stearic Acid ，C18:0 ）：為有光澤的白色片狀結晶體，不溶于水，而溶於乙醇，醚和氯仿。熔點64－71℃，在浸蠟中加入少量的硬脂酸可增加石蠟的滲透性。有人用硬脂酸和石蠟混合液置於溫箱中代替二甲苯透明。
松香（rosin）：為棕黃色半透明的固體。質硬而脆，遇熱熔解，呈膠體狀，同石蠟混合時，可增加石蠟的硬度，由於松香質脆，混合後可增加硬度但韌性不足。
組織浸蠟時間也應視組織種類大小和結構不同而異。在整個浸蠟過程中，標本大小對完成浸蠟所需的時間有很大影響。較厚的組織需要較長時間才能使蠟浸入中心，而且厚的組織常帶入的透明劑比較多，故需要多次浸蠟才能將透明劑除去。即使少量透明劑也會沾汙石蠟而產生結晶，致使切片時切片易碎裂。也要考慮組織的種類，骨，皮膚和中樞神經系統等緻密組織要比軟組織如肝腎等需要加倍時間。含血多的組織，肌肉和纖維束在蠟內易過硬而發脆，故浸蠟時間應縮短。疏鬆組織，脂肪，消化道組織等浸蠟時間可以適當延長一些。為了盡可能排除透明劑。浸蠟可以分兩級或三級進行。以熔點較低的軟石蠟作為第一步，然後再換為熔點較高的石蠟作為第二步，第三步。浸蠟時間1－4小時，或更長，並使之過夜則較易切割，如此浸漬的組織切片在乾燥箱內乾燥也不易捲曲和龜裂。組織浸蠟時間也應視組織種類大小和結構不同而異。在整個浸蠟過程中，標本大小對完成浸蠟所需的時間有很大影響。較厚的組織需要較長時間才能使蠟浸入中心，而且厚的組織常帶入的透明劑比較多，故需要多次浸蠟才能將透明劑除去。即使少量透明劑也會沾汙石蠟而產生結晶，致使切片時切片易碎裂。也要考慮組織的種類，骨，皮膚和中樞神經系統等緻密組織要比軟組織如肝腎等需要加倍時間。含血多的組織，肌肉和纖維束在蠟內易過硬而發脆，故浸蠟時間應縮短。疏鬆組織，脂肪，消化道組織等浸蠟時間可以適當延長一些。為了盡可能排除透明劑。浸蠟可以分兩級或三級進行。以熔點較低的軟石蠟作為第一步，然後再換為熔點較高的石蠟作為第二步，第三步。浸蠟時間1－4小時，或更長，並使之過夜則較易切割，如此浸漬的組織切片在乾燥箱內乾燥也不易捲曲和龜裂。
三傳統浸蠟法 這是手工操作和不帶真空負壓的浸蠟方法。根據石蠟的熔點，確定浸蠟箱的溫度。如硬蠟的熔點為62℃,浸蠟箱的溫度應比石蠟熔點高出2~3℃，即浸蠟箱調在65℃，當確定好後，將組織放入軟蠟，後轉入硬蠟，根據不同的組織，組織的大小來確定浸蠟時間，小組織20~30分鐘，大組織幾個小時不等。
四、真空負壓浸蠟法 真空負壓浸蠟法應用一真空泵，將箱內的空氣抽出來，形成真空負壓，在這種條件下，由於失重，各種分子活動加快，促使浸蠟過程迅速完成。為了浸蠟完全徹底，全密閉自動脫水機配有這一功能。
真空負壓浸蠟法使用時的注意事項： • 真空恒溫乾燥箱的溫度應略高於傳統浸蠟法，因為在抽氣形成真空時，箱中的熱氣會被抽出，致使箱中溫度下降，使熔化的石蠟凝結成塊，所以溫度調至70度左右為宜。 • 計時應從浸蠟完全熔化時計起。抽氣時，箱中的溫度下降，此時浸組織塊的蠟如果處於凝固時，應待其熔化後，方可計時。
(1)、常規組織處理程式 1、組織塊沖水24小時。2、70%酒精24小時。3、 80%酒精12小時。4、 90%酒精12小時。5、 95%酒精（1）2小時。6、 95%酒精（2）2小時。7、 100%酒精（1）1小時。8、 100%酒精（2）1小時。9、 二甲苯（1）30—60分鐘。10、二甲苯（2）30—60分鐘。11、 軟蠟1小時。12、 硬蠟2—3小時。
(2)胃腸粘膜處理程式 • 1、70%酒精10min。2、 80%酒精10min。3、 90%酒精10 min。4、 95%酒精10min。5、 100 %酒精10min。6、 二甲苯5—10 min。7、 浸蠟15 min。
(3)臨床手工脫水法。 • 1、80%酒精過度。2、 95%酒精過夜。3、 100%酒精（1）1小時。4、 100%酒精（2）1小時。5、 二甲苯（1）30—60 min。6、 二甲（2）30—60 min。7、 浸蠟（真空負壓）90—120 min。
