The Journal of Biological Chemistry , published on September 25th, 2009 as Manuscript

1. The macrophagecholesterolexporter ABCA1 functionsasananti-inflammatoryreceptor The Journal ofBiologicalChemistry, published on September 25th, 2009 asManuscript Chongren Tang, Yuhua Liu, Peter S.Kessler, Ashley M.Vaughan and John F.Oram Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine, University of Washington, Seattle.

2. ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) è una proteina integrale di membrana, responsabile dell’efflusso del colesterolo dalle cellule e… ...espleta un’azioneimmunomodulante!!!

3. Funzione e trasporto del colesterolo • Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1 • Receptor-like activity and lipid transport model

4. Il colesterolo è un metabolita abbondante nei tessuti dei mammiferi,essenziale per parecchie funzioni biologiche. Esteri del colesterolo ACAT Fluidità di membrana Precursore VitaminaD Lipid rafts Acidi Biliari Ormoni steroidei: -Mineralcorticoidi, -Glucocorticoidi, -Ormoni sessuali

5. 8 1 6c 6a 6b 4 5 2 7 6 3

6. Le lipoproteine sono formate da : 1) apoproteine (alfa-elica amfipatica) 2) fosfolipidi 3) trigliceridi 4) colesterolo libero ed esterificato 5) acidi grassi liberi

7. Classificazione delle Lipoproteine %proteine 1-2 7-10 10-12 20-22 30-35 55-77 99

8. LDL  Le LDL sono il principale trasportatore di colesterolo ai tessuti. L'uptake delle LDL avviene per via recettoriale al fegato (75/%), corteccia surrenale e tessuto adiposo e MACROFAGI.

9. 5 1 3b 2 4a 4b 3a

10. Immagine in TEM dell’endocitosi Mediata da recettore delle LDL

11. HDL A subfractionofcirculatinglipoproteinscalledhigh-densitylipoproteins (HDLs) isinvolved in the export ofexcesscholesterolfromcells Core di esteri del colesterolo • Una delle maggiori funzioni delle HDL è il trasporto del colesterolo dai tessuti periferici al fegato, dove esso viene escreto nella bile. • Si ritiene che la rimozione dell’eccesso di colesterolo dai macrofagi del connettivo vascolare da parte delle HDL abbia un ormai ben stabilito effetto cardioprotettivo.

13. Sono stati identificati tre trasportatori di membrana che mediano l’efflusso del colesterolo dalle cellule alle componenti delle HDL. Essi appartengono alla superfamiglia “ ATP-binding cassette transporters (ABCs) “[trasportatori di membrana ATP-dipendenti]: • ABCA1trasporto di colesterolo, fosfolipidi ed altri metaboliti alle apoproteine delle HDL; è altamente espresso in fegato e macrofagi tissutali; • ABCG1 e ABCG4trasporto del colesterolo a HDL e altre lipoproteine; ABCG1 è anch’esso espresso nei macrofagi e lavora in sinergia con ABCA1 nel rimuovere il colesterolo in eccesso. ABCG4 è selettivamente espresso nei neuroni dove è specializzato nel trasporto lipidico

14. Funzione e trasporto del colesterolo • Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1 • Receptor-like activity and lipid transport model

15. ABCA1 WalkerA WalkerC NBD2 NBD1 WalkerB

16. Substrati Accettori Fosfolipidi (fosfatidilcolina) Colesterolo Apolipoproteine di HDL: A-I, A-II, E, C-I, C-II, C-III, A-IV PLTP: phospholipid-transfer-protein Proteine contenenti alfa-eliche anfipatiche (11,22aa),in cui gli aa carichi si dispongono lungo una faccia dell’asse,gli aa idrofobici sulla faccia opposta!

17. The cellular transporter ABCA1 is a critical protein that transports excess free cholesterol (FC) out of the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I. ABCA1 gene transcription is regulated by the nuclearreceptor heterodimer liver X receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular oxysterols appear to be one of the endogenous ligands for LXR and promote the transcription of ABCA1. Oxysterols are generated from free cholesterol. Presumably, this represents a homeostatic mechanism by which macrophages rid themselves of excess free cholesterol. LXR gene transcription is also influenced by both peroxisomeproliferator-activated receptor  (PPAR-) andPPAR- Cytogenetic location: 9q31.1

18. A-I PPARs oxysterols LXR/RXR ABCA1

19. Funzione e trasporto del colesterolo • Struttura e regolazione dell’espressione di ABCA1 • Receptor-like activity and lipid transport model

20. Receptor-like activity ABCA1 is unique among eukaryotic ABC transporters that requires the direct binding of the acceptor for the transported substrate.The ABCA1 binding determinant of apolipoproteins is the amphipatic α-helix.This binding may be mediated by the large extracellular loops of ABCA1,which are unique for this family of transporters.

21. The interaction of apolipoproteins with ABCA1-expressing cells also activates signaling molecules that modulate ABCA1 expression or lipid transport activity:these findings suggest that apolipoprotein/ABCA1 interactions behave like a ligand/receptor system.In fact, this interaction stimulates autophosphorylation of tyrosine kinase Jak2,thus generating the active Jak2:apo A-I potentiates its own interaction with ABCA1 by activating Jak2,which in turn increases the apo A-I binding to ABCA1 required for lipid removal RECEPTOR ACTIVITY (FEEDFORWARD MECHANISM)

22. LIPID TRANSPORT MODEL Chamber P ATP ADP

23. 2 5 3 4 HDL (A)Phospholipids and perhaps free cholesterol ( C ) are translocatedacross the plasma membrane toformtightlypacked and disorderedlipiddomainsthat protrude from the cells. (B)Apo A-I bindsto ABCA1 and stimulatesphosphorilationof Jak2.( C ) The phosphorilated/activated Jak2 enhances the Apo A-I bindingto ABCA1 requiredforinteractionwithlipiddomainsgeneratedby ABCA1.(D)Apo A-I solubilizes the lipidstoformnascent HDL particles.

24. ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) è una proteina integrale di membrana, responsabile dell’efflusso del colesterolo dalle cellule e… ...espleta un’azioneimmunomodulante!!!

25. Cholesteroluptake • LDL e oxLDL • Uptake di oxLDL: recettori Scavenger • Signaling pathway associato a Recettori Scavenger

26. LDL/LDL-R …Le LDL sono tutte uguali? LDL

27. oxLDL (LDL modificate) LDL Danno da Radicali Liberi (ROS,RNS): -respirazione cellulare(mitocondriale) -ossidasi microsomiali -catalizzatori chimici (metalli di transizione) -prodotti di PMN (NADPH ossidasi, Mieloperossidasi) -introito alimentare di lipidi ossidati (termo-ossidazione:frittura)

28. Perossidazione del colesterolo

29. LDL oxLDL Acido linoleico (C18) Acido 9-idrossi-octadecadienoico Tirosina nitrotirosina Glucosio Steroli ossiSteroli Formazione di AGECross Links

30. Site of chemical modifications in in vivo LDL− and ONOO−-treated LDL The secondary structure of the apoB-100 is showed. We show the chemical modificationsin LDL− and ONOO−-treated LDL.

31. Gli AGE sono in grado di modificare i gruppi aminici primari dei fosfolipidi e delle apo(B-100) delle lipoproteine a bassa densità (LDL). Gli AGE, inoltre, sono in grado di iniziare una serie di reazioni ossidative che promuovono la generazione di LDL ossidate.

32. Treatment of native LDL with ONOO- resulted in extensivetyrosine nitration , accumulation of lipid peroxides, and loss of α-helicalstructure and, as a corollary, formation of oxLDL: • Nitrotyrosine and lipid peroxide accumulation are synergistically responsible forunfolding of α-helices inherent in LDL− formation. tyrosine nitration lipid peroxides • Glucose reacts nonenzymatically with the amino groups of proteins to form stable, cross-linking adducts called advanced glycation end products or AGEs. cross-linking

33. Self o NON-SELF? (that’s the question!) SELF ALTERATO!!

34. Le LDL modificatesembra che possano essere riconosciute da recettori specifici a livello delle cellule endoteliali e dei monociti/macrofagi e sono in grado quindi di indurre modificazioni fenotipiche di tipo secretorio e proliferativo. Motilità dei macrofagi sulla parete arteriosa oxLDL Azione chemiotattica induce Pattern di espressione genica (geni della flogosi) IMMUNOGENA Citochineproinfiammatorie Molecole di adesione cellulare

35. .oo OOH ONOO- le LDL modificate (oxLDL) non vengono riconosciute dal recettore fisiologico LDL-R ROOH come vengono internalizzate?

36. Recettori SCAVENGER Per Recettori scavenger(=“spazzini”) s’intende un gruppo di recettori capaci di legare le LDL modificate(ossidate,acetilate). Sono prevalentemente espressi sui macrofagi(immunità innata)

37. LOX-1: lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 • Scavenger receptor class A: -Trimers -collagene-like domain -cysteine-rich domain • Scavenger receptor class B: -two transmembrane domains -situated in specific plasma membrane microdomains, the caveolae (lipid rafts). They preferentially bind modified LDL by acetic acid and oxidized LDL CD36

38. Recettore Scavenger di classe A Recettore Scavenger di classe B

39. The binding of oxidized low density lipoprotein(LDL) to CD36 is mediated in part by oxidized phospholipids that are associated with both the lipid and protein moieties of the lipoprotein. endocitosi Ossisteroli Oxidizedfatty acid

40. CD36-dependent signaling pathway Proteina adattatrice Ras_GDP GTP P LYN Grb2-SoS P JNK MAPK ATP Fos P ATP Vav AP-1 site of interaction with Src- tyrosine kinases Dominio di omologia CD4/CD8: CysXCysX 5lys (CXCX 5K) Src-familynonreceptorproteintyrosinekinases fyn, lyn Jun Rac-GDP GTP P

41. Proteina adattatrice P PLC LYN P PKC P P IKK P IκB NF- κB

42. TNFα • iNOS • Fas • MMPs • CD40 • IL-1 • IL-6,IL-12 • CCL2(MCP-1) Induzione della Flogosi • Fas • IL12 • MMPs • (MMP1, MMP2, MMP3, MMP13) Innesco dei meccanismi effettori dell’immunità innata Jun Activator Protein – 1 (AP-1) Fos P NF- κB

43. Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo LDL oxLDL CD36 Geni della Flogosi

44. Macrophage response to oxidized lipid-loading:A PATHWAY FOR CHOLESTEROL EFFLUX

45. PPARγ-LXRα-ABCA1 Pathway FoamCells CD36 (Meccanismoa feedback) PPARγ Attiva la trascrizione di LXRα RXR α

46. ABCA1 Efflusso di colesterolo (Apo-A1) Sembra,quindi,che il rilascio di colesterolo e lipidi ossidati dalle oxLDL provveda alla clearance dei lipidi attraverso la trascrizione attivata di ABCA1

47. Uptake delle oxLDL • Induzione di un nuovo profilo trasduttivo (profilo infiammatorio) Upregulation di ABCA1 APO-A1 Geni della Flogosi CD36 ABCA1 HDL oxLDL LXRα PPARγ

48. ABCA1asan anti-inflammatoryreceptor

49. APO-A1 P

50. ESPERIENZE