M2 Infectiologie Cellulaire et Moléculaire, Vaccinologie Module 5 La barrière mucosale

1. M2 Infectiologie Cellulaire et Moléculaire, VaccinologieModule 5 La barrière mucosale LALMANACH A-C, INRA Centre de Recherche de Tours, 37380 Nouzilly • La muqueuse • Morphologie • Histologie • Les cellules épithéliales • La barrière mucosale • La surveillance: sonder et contrôler, informer et réagir • La tolérance orale • Immunité innée muqueuse: les peptides anti-microbiens • Structure • Production • Mode d ’action

2. La muqueuse L ’intestin • énorme surface d ’échange: la face luminale (interne) du petit intestin présente des repliements circulaires, eux-même recouverts de villosités. • Plus de 300m2 de surface chez l ’adulte. • Au contact d ’une microflore intestinale abondante et complexe: environ 1014 bactéries (dont 1012 bact/g de feces dans le colon) plus de 400 espèces bactériennes • Deux parties: petit intestin (proximal) et gros intestin (avec le colon).

3. La muqueuse Le petit intestin • Le petit intestin représente la plus grande partie du tube digestif et est composé de trois partie de l ’estomac jusqu ’au gros intestin • Le duodenum (reçoit les sécrétions pacréatiques, hépatiques et biliaires) • Le jejunum (la plus grande des 3 parties, 40 à 90% selon les espèces) • L ’ileum (sedéverse dans le gros intestin • Sa longueur est d ’approximative-ment 3,5 fois celle du corps (soit environ 6m chez l ’homme). • C ’est le siège des étapes finales de la digestion permettant l ’absorption de nutriments dans la circulation.

4. La muqueuse Morphologie de la surface Lumière Lumière Microscopie électronique à balayage Microscopie optique (coloration HE) Microscopie électronique à transmission • Villi (angl): villosités. La muqueuse envoie une multitude de projections vers la lumière qui sont recouvertes de cellules épithéliales • Cohésion et étanchéité assurées par des jonctions intercellulaires spécialisées

5. La muqueuse Structure des cellules épithéliales Cohésion et étanchéité assurées par des jonctions intercellulaires spécialisées • Jonctions serrées ou tight junctions (TJ) • Jonctions adhérentes (zonula adherens ZA) • Desmosomes (D) Microscopie électronique, cryofracture Microscopie électronique à transmission

6. La muqueuse Structure des cellules épithéliales Connections entre cellules assurées par des jonctions intercellulaires spécialisées: jonctions gap Synchronisation des cellules, passage intercellulaire de molécules...

7. La muqueuse Différents types de cellules épithéliales 3 principaux types de formes • Squameuses (squamous): aplaties, empilées en quinconce.Composent le revêtement de la peau (épiderme) et bordent certaines cavités internes (buccale). • cuboïdes (cuboidal): relativement arrondies, déformables et formant une couche élastique. Bordent la vessie, et les organes sujets à déformation (capacité de rétention de liquide). • en colonne (columnar): hautes et étroites en simple couche de cellules sécrétrices et absorbantes. Bordent le tractus gastro-intestinal et forment la bordure ciliée du tractus respiratoire 3 principaux types d ’assemblages des cellules Simples, stratifiés, pseudostratifiés.

8. La muqueuse Différents types d ’épithéliums • Columnar, simple (gut) • Cuboidal, simple( kidney) • Squamous, simple (lung) • Squamous, stratified (skin)

9. La muqueuse Cellules épithéliales • Intestinales: enterocytes, Goblet cells, Paneth cells • pulmonaires: ciliées, Goblet cells Coupe longitudinale: les « basal bodies » au départ de chaque cil sont formés par les centrioles. Structure des cils en microscopie électronique à transmission. Coupe transversale: noter les 9 doublets de microtubules et les deux singlets au centre qui forment l ’architecture de chaque cil.

10. La muqueuse Cellules épithéliales • Polarisation Pôle apical: côté lumière intestinale. Pôle basolatéral: côté lame basale et lamina propria Réseau complexe de microfilaments du cytosquelette: Anneaux d’actine à chaque pôle. Filaments intermédiaires dans tout le cytoplasme et points d’ancrage à la membrane plasmique • Durée de vie limitée: quelques jours

11. La muqueuse Cellules épithéliales Goblet cells avec leur poche à mucus Le renouvellement des cellules de l ’épithélium se fait par prolifération de cellules souches au niveau de la crypte, qui migrent et se différencient vers le sommet de la villosité ou elles meurent (apoptose) et exfolient. (implication de EGF, FGF, HGF et ITF).

12. La muqueuse Ontogénie de l ’épithélium intestinal • Morphogenèse du tube digestif à partir de l ’endoderme : semaine 4 de gestation. • Monocouche de cellules épithéliales à jonctions serrées : semaine 10. • différentiation de cellules caliciformes à production de mucus : semaine 12. • Première synthèse des a-défensines par les cellules de Paneth : semaine 13; production de lysozyme : vers la semaine 20. • Expression du FcRn à partir de 18 semaines (transfert d ’immunité passive, IgG dans le liquide amniotique vers 12 semaines et dans le lait maternel). • Apparition des follicules B, zones T et plaques de Peyer : semaine 19 (après la naissance chez la souris).

13. La muqueuse La fonction de barrière L ’objectif est de prévenir le passage de pathogènes de la lumière vers la lamina propria et dans la circulation sanguine. Les barrières physico-chimiques aux infections: poumons - ascenceur mucociliaire - surfactant intestin - péristaltisme - pH acide - sels biliaires - thiocyanate - flux gastro intestinal

14. La muqueuse La fonction de barrière Barrière extrinsèque: pour restreindre la quantité d ’Ag atteignant la surface de l ’intestin. • Protéolyse et acidité gastrique • Péristaltisme • Couche de mucus • Anticorps • Flore commensale Barrière intrinsèque: caractéristiques physiques de l ’épithélium lui-même production de défensines.

15. La muqueuse La fonction de barrière La flore intestinale commensale • Aide à la digestion (Ruminococcus, Fibrobacter chez les ruminants) • Dégradation des glycoprotéines du mucus (bénéfice mutuel: source alimentaire pour la flore et désengorgement du mucus) • Compétition vis-à-vis des microbes pathogènes: compétition de nutriments, production de bacteriocines, interférence avec les signaux du quorum sensing. • Angiogenèse et développement de l’immunité innée* * L. Hooper et al., Science 2001, 291: 881-884.

16. La muqueuse La fonction de barrière Maintien de l’homeostasie intestinale: état d ’équilibre Prévenir une réponse excessive aux antigènes alimentaires et à la flore commensale sans danger (tolérance) Etablir une réponse immune protectrice contre des pathogènes intestinaux

17. PRR = pattern-recognition receptors Toll-like receptors TLR2 -> Lipoprotéines TLR4 -> LPS TLR5 -> flagelline TLR9 -> motifs CpG non méthylés de l ’ADN bactérien NucleotideBinding Site+Leucine Rich Repeats (NBS-LRR) CARD4/Nod1 et Nod2 Sur les enterocytes, les phagocytes et les cellules dendritiques DC La muqueuse La surveillance: sonder le monde extérieur Discrimination entre flore commensale bénéfique et pathogènes nuisibles: reconnaissance de motifs moléculaires de surface (MAMPs) par des récepteurs (PRR) MAMPs = Microbe-associated molecular patterns LPS acide lipoteichoïque peptidoglycanes lipoprotéines... Intracytoplasmique

18. La muqueuse La surveillance: sonder le monde extérieur Pathologies inflammatoires intestinales: situations de déséquilibre • IBD (inflammatory bowel disease): Crohn ’s disease et ulcerative colitis Réactivité aux bactéries de la flore commensale Accessibilité accrue de PRR à la surface apicale des enterocytes « Hyper-réponse » aux MAMPs (Nod2= gène de sensibilté à la maladie de Crohn)*. Développement de l ’IBD chez la souris déficiente en IL-2 Induction des beta-défensines 2 et 3 humaines abrogée durant la maladie de Crohn. *Y. Ogura et al., Nature 2001, 411: 603. J. P. Hugot et al., Nature 2001, 411: 599.

19. La muqueuse La surveillance: sonder et contrôler (immunité innée) Les signaux transduits par les PRR déclenchent une réponse inflammatoire et la production de chimiokines recrutant les phagocytes Effet consensus: activation de la voie NF-B Phosphorylation de IkB Ubiquitination de IkB Expression des gènes de la réponse inflammatoire Dégradation de IkB Activation de la transcription de gènes

20. La muqueuse La surveillance: sonder et contrôler (immunité innée) Stimulation de l ’épithélium par les PAMPs: activation de la voie NF-B Expression de l ’IL-8, de l ’IL-1, du GMCSF, de GRO et MCP-1. Recrutement des polynucléaires neutrophiles, des macrophages et activation de la réponse inflammatoire. Sollicitation de l ’immunité innée

21. La muqueuse La surveillance: sonder et contrôler (immunité innée) Les signaux transduits par les PRR peuvent aussi déclencher une réponse pro-apoptotique menant à la mort cellulaire programmée. Microbial stimuli Initiator caspases (Caspase 8) NF-kB Pro-inflammatory effectors Anti-apoptotic effectors Effector caspases Inflammatory response Apoptosis Elimination of infected cells Recruitment of innate and adaptive immune cells inhibition activation

22. La muqueuse La surveillance: sonder et contrôler Inocuité de la flore commensale ? • Peu de reconnaissance de motifs moléculaires de surface (MAMPs): masquage des MAMPS des commensaux par les IgAs* • Peu de PRR accessibles à la surface apicale des enterocytes • Régulation négative de la voie NF-B par des bactéries non pathogènes**. Signaux délivrés à l ’épithélium pour limiter les réponses inflammatoires. « Répression » inflammatoire. * AJ Macpherson & T Uhr, Science 2004, 303:1662-1665. ** A Neish et al., Science 2000, 289: 1560-1563.

23. La muqueuse La surveillance: sonder et contrôler « Camouflage » de la flore commensale: rôle des IgA sécrétoires (IgA) Produites en majorité par les lymphocytes B220+ IgM+ (T -indép), plasmocytes. Neutralisation d’antigène Aide à la destruction virale Elimination d ’antigène 1 et 2: Liaison des IgA dimériques (dIgA) au polyIg récept. (pIgR) côté basolatéral de l ’épithélium et transcytose (via réseau d ’endosomes). 3: Clivage du grand domaine extracellulaire du pIgR, libérant l ’IgA sécrétoire associée au composant sécrétoire dans la lumière intestinale. Prévenir l ’invasion de l ’hôte par la flore intestinale

24. La muqueuse La surveillance: informer et réagir (immunité spécifique) Le passage de microorganismes est possible mais contrôlé: « sampling ». 1. Passage direct, au travers des cellules épithéliales 2. Passage via les cellules M qui surmontent les zones lymphoïdes folliculaires 3. Captation par les cellules dendritiques qui envoient des extensions dans la lumière intestinale

25. La muqueuse La surveillance: informer et réagir (immunité spécifique) La cellule M « super captatrice » - bordure en brosse désorganisée - glycocalix réduit - pas de sécrétion de mucus -expression de CCL20 Recrutement de cellules dendritiques immatures dans le dôme subépithélial La cellule dendritique « super sentinelle » muqueuse.

26. Les lymphocytes T de la lamina propria sont effecteurs / mémoire et issus de la migration de cellules T: sites inducteurs (« priming » par les DC dans les follicules lymphoïdes et ganglions drainant) recirculationT et « homing » des T (47 MAdCAM. La muqueuse La surveillance: informer et réagir (immunité spécifique) La réponse T: développement d ’une immunité spécifique des antigènes dérivés des pathogènes Les lymphocytes intra épithéliaux (IEL): majoritairement CD8+ TCR ou TCR  à répertoire restreint CMHI non conventionnel des cellules épithéliales intestinales (IEC). Les IEL expriment l ’intégrine E7 qui interagit avec la E-cadhérine des cellules épithéliales.. Recirculation des lymphocytes stimulés, via la lymphe canal thoracique puis circulation générale et domiciliation muqueuse intestinale.

27. 47 intégrin MadCAM-1 addressin des lymphocytes primés des cellules endothéliales de veinules post-capillaires de l ’intestin CCR9/CCR10 CCL25 et MEC (mucosa-associated des lymphocytes primés epithelial chemokine) La muqueuse La surveillance: informer et réagir (immunité spécifique) La circulation des lymphocytes Les lymphocytes T et B stimulés au niveau des MALT (mucosa associated lymphoid tissue) acquièrent des récepteurs de domiciliation muqueuse: l ’intégrine 47 . Mise en place de l ’immunité spécifique

28. La muqueuse La tolérance orale La rencontre d ’un antigène (Ag) au niveau de l ’intestin déclenche un processus inhibiteur prévenant l ’établissement de réponses cellulaires spécifiques de cet Ag (TCD4+ et TCD8+) suivant une immunisation systémique avec le même Ag. Immunosuppression Prévention d ’une hypersensibilité retardée aux antigènes alimentaires et de la flore commensale

29. La muqueuse La tolérance orale • La muqueuse du petit intestin représente le siège d ’induction de la tolérance orale. • Les cellules épithéliales expriment des molécules du CMH I et II atypiques et ne possèdent pas de molécules de co-stimulation indispensables à la présentation d ’Ag induction d ’anergie? • Les lymphocytes T intestinaux de la lamina propria sont majoritairement effecteur/mémoire et peu sont naïfs. • Les cellules épithéliales ayant rencontré un Ag intestinal peuvent ëtre suppressives vis à vis de cellules TCD8+ spécifiques via la sécrétion d ’IL10 et de TGF .

30. Mécanisme, selon la dose d ’antigène • Faible dose: immuno-suppression médiée par les cellules Treg. • Forte dose: immuno-suppression médiée par anergie/délétion des cellules T spécifiques de l ’antigène. différenciation CD4+ Treg Th3: production de TGF et peu d ’IL10. relayée par les DC reg (IL10) Immuno-suppression induction induction Tr1: production d ’IL10 et peu de TGF. TCD4+ et TCD8+ différenciation La muqueuse La tolérance orale Les cellules T régulatrices: CD4+ Treg CD4+ CD25+ T cells

31. M2 Infectiologie Cellulaire et Moléculaire, VaccinologieModule 5 La barrière mucosale LALMANACH A-C, INRA Centre de Recherche de Tours, 37380 Nouzilly • La muqueuse • Morphologie • Histologie • Les cellules épithéliales • La barrière mucosale • La surveillance: sonder et contôler, informer et réagir • La tolérance orale • Immunité innée muqueuse: les peptides anti-microbiens • Structure • Production • Mode d ’action

32. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Eléments essentiels de l ’immunité innée de l ’épithélium: fonction barrière intrinsèque. • Deux familles de peptides antimicrobiens des mammifères : • Les cathélicidines, à grande variété de structure primaire et secondaire mais prorégion hautement conservée. • Les défensines, , , ou . Les deux sous-familles  et  de défensines sont codées par un cluster d ’au moins 8 gènes sur le chromosome 8p23. Les peptides antimicrobiens sont ≤ 5 kDa. Tous possèdent une activité bactéricide directe à large spectre (gram+ et gram-), à faible concentration micromolaire in vitro.

33. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Autres facteurs anti-microbiens: Chez la souris, CRS (cryptdin related sequence) peptides formant des homo ou hétérodimères. BPI protéine de 55kDa, constituant des polynucléaires neutrophiles, capable de se lier au lipide A du LPS et déstabiliser la membrane externe des bactéries gram-. Enzymes intestinales antimicrobiennes: PLA2 et lysozyme, dans les granules de Paneth et de neutrophiles Angiogénine 4

34. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Les peptides antimicrobiens sont des facteurs de l’immunité innée relativement bien conservés au cours de l’évolution. Retrouvés dans le règne végétal et animal. Identifiés chez les insectes jusqu’à l’homme en passant par les oiseaux (-défensines). Analogie des séquences signal des gallinacines (b-défensines aviaires) et des peptides cytotoxiques de venin de serpent*. Analogie structurale des peptides du venin de platypus, de la -défensine 1 de neutrophile bovin et d’un peptide neurotoxique de l’anémone de mer * C Zhao et al., Infect. Immun. 2001, 69: 2684-2691.

35. Position stratégique en protection des cellules souches multipotentes de l ’épithélium Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Les cellules productrices intestinales Les défensines identifiées à partir des cellules de Paneth: les -défensines dans les granules sécrétrices. Localisation of HD5 mRNA (left, silver staining) and peptide (right, brown peroxydase product)*. Les entérocytes différenciés du gros intestin peuvent produire des -défensines et des cathélicidines. * G. Diamond & C.L. Bevins, Clin. Immunol. Immunopathol. 1998, 88: 221-225. E. Porter et al. Infect. Immun. 1997, 65: 2389-2395.

36. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Les cellules productrices • Produits par les cellules épithéliales et les phagocytes : • Les phagocytes (polynucléaires neutrophiles) stockent les peptides antimicrobiens dans des granules. • Les cellules de Paneth peuvent sécréter les peptides anti-microbiens et/ou les stocker dans des granules. • Exprimés de manière constitutive ou inductible: • HBD1, HBD3 et HBD4 exprimés constitutivement par les cellules épithéliales du petit et gros intestin • L’expression d’HBD2 est stimulée par les cytokines inflammatoires et par TLR2 et TLR4.

37. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Les cellules productrices • Dans les polynucléaires neutrophiles (PMN) humains : • 4  -défensines stockées dans les granules azurophiles qui iront fusionner avec le phagosome. • 1 cathélicidine (LL-37) stockée dans des granules spécifiques secondaires et délivrée dans le milieu extracellulaire. Le type et le nombre de peptides anti-microbiens dans les PMN de mammifères varie selon l ’espèce.

38. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens La structure Rabbit -defensin Dimeric human -defensin Monomeric human -defensin Rhesus Macaque -defensin Conformation similaire entre  et  défensines.

39. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens La structure Feuillets béta caractéristiques des  et  défensines.

40. Comparaison des sous-familles de défensines des vertébrés Structure Taille (kDa) Résidus Appariements Cys Source  -Défensines feuillet  3,5-4 29-35 1-6, 2-4, 3-5 hum., lapin, rat souris  -Défensines feuillet  4-6 38-42 1-5, 2-4, 3-6 hum., bov., poulet mouton, porc...  -Défensines cyclique 2 18 1-4, 2-5, 3-6 singe Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens La structure La position des 3 ponts disulfures entre les 6 résidus cystéine dans la séquence définit la sous-famille de défensine.

41. 1 2 3 4 5 6 Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Homologies structurales liées à homologies de séquence Les  défensines Chez la souris il existe 20 isoformes d’  défen-sines nommées cryptdines. La cystéine 1 est localisée côté N-terminal.

42. 3 6 2 4 1 5 Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Homologies structurales liées à homologies de séquence Les  défensines

43. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Production de la forme active Maturation par clivage de la prorégion pour libérer le peptide actif. Chez la souris, les cryptdines sont maturées dans les granules des cellules de Paneth grâce à la MMP7 (matrix metalloprotease matrilysin). Chez l’homme, la pro-forme de l’HD5 est sécrétée puis maturée dans la lumière intestinale (pas de MMP7 connue). La forme active peut aussi être sécrétée.* * D Ghosh et al., Nature Immunol. 2002, 3: 583-590..

44. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Activité biologique Perturbation et rupture membranaire des pathogènes. • Molécules cationiques -> affinité pour les charges négatives de surface des membranes bactériennes • Molécules amphipathiques (analogues aux détergents) -> désorganisation membranaire et rupture des gradients électrochimiques Large spectre d’activité (gram+ et gram-). • Escherichia coli • Salmonellatyphimurium • Listeriamonocytogenes …

45. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Activité biologique Perturbation membranaire : mécanimes d’action Modèle de formation de pore par les peptides à hélice .

46. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Activité biologique Perturbation membranaire : mécanimes d’action

47. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Activité biologique Activité de type chimiokine Liaison entre immunité innée et adaptative HBD2 et CCL20 ont une structure 3D similaire et partagent la même affinité pour le récepteur CCR6 Recrutement des cellules dendritiques (DC) et des cellules T Remarque: inversement, il a été montré que certaines chimiokines présentent une activité bactéricide directe, analogues aux peptides anti-microbiens.

48. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Activité biologique

49. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Résistance bactérienne aux peptides anti-microbiens • Réduction de la charge négative globale de la membrane bactérienne • limiter l ’accès des peptides cationiques • modification du phosphatidyl glycerol avec la L-lysine (gène mprF de S.aureus). • alanylation de l ’acide teichoïque et lipoteichoïque (opéron dlt). • Acylation du lipide A du LPS (gènes phoP-phoQ, gène pagP de S. Typhimurium).

50. Immunité innée muqueuse Les peptides anti-microbiens Résistance bactérienne aux peptides anti-microbiens Sécrétion de protéases dégradant les peptides anti-microbiens • protéase de la membrane externe de S. Typhimurium (pgtE) Pompes d’efflux évacuant les peptides anti-microbiens • gène mtrCDE de Neisseria gonorrhoeae • gène qacA de Staphylococcus aureus