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Tema 15 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA I

Tema 15 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA I. Introducción 2. Inhibición reversible 2.1 Inhibición competitiva (inhibición específica) 2.2 Inhibición no-competitiva 2.3 Inhibición incompetitiva o acompetitiva 2.4. Representación de Dixon 2.5 Inhibición por sustrato. 1. Introducción.

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Tema 15 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA I

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  1. Tema 15 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA I • Introducción • 2. Inhibición reversible • 2.1 Inhibición competitiva (inhibición específica) • 2.2 Inhibición no-competitiva • 2.3 Inhibición incompetitiva o acompetitiva • 2.4. Representación de Dixon • 2.5 Inhibición por sustrato

  2. 1. Introducción Desde el principio de la Enzimología se sabia de sustancias que disminuían la velocidad de la reacción catalizada por los catalizadores, “envenenando” o dificultando la actuación de éstos. Las sustancias que disminuyen la velocidad de reacción, química o enzimática, se denominan inhibidores. Los inhibidores se pueden dividir en tres grandes grupos: • Inhibidores reversibles, • Inhibidores pseudorreversibles • Inhibidores irreversibles

  3. Inhibidores reversibles la unión del inhibidor a la enzima es débil. • Inhibidores pseudoirreversibles la unión del inhibidor a la enzima es fuerte. • Inhibidores irreversibles  la unión del inhibidor a la enzima es prácticamente irreversible, generalmente covalente(inhibidores suicidas).

  4. 2. Inhibición reversible Los inhibidores reversibles son sustancias que forman complejos “dinámicos” o reversibles con la enzima ( interacciones de tipo débil) y que presentan propiedades catalíticas diferentes a las de la enzima libre. Cumplen las condiciones impuestas al Substrato para la deducción de la ecuación cinética de M&M: La concentración inicial de inhibidor [Io] >> [Eo]

  5. que para resolver la ecuación de velocidad en presencia de inhibidor, • [EI] o [ESI] es despreciable frente a la de [Io]. Por lo tanto, en todo momento, [I] = [Io] Por otra parte, la formación de los complejos EI o ESI es muy rápida, de forma que se alcanza rápidamente el siguiente equilibrio: E + I <=====> EI y podemos definir la constante de disociación del complejo EI: [E] [I] Ki = ------------ [EI]

  6. Donde. [E] concentración de enzima libre [I] concentración de inhibidor libre [EI] concentración del complejo EI -Así mismo, debemos tener en cuenta: i) que la actividad de la enzima se afecta por la presencia del inhibidor ii) que las velocidades medidas son velocidades iniciales iii) que estamos en una situación de estado estacionario Consecuentemente, la concentración de las diferentes especies químicas en que puede encontrarse la enzima: [E], [ES], [EI]y en su caso [ESI] son constantes respecto del tiempo,  d[EX]/dt = 0.

  7. Si la enzima, a concentraciones saturante de inhibidor, no presenta actividad catalítica alguna (v = 0) se dice que la inhibición es completa o total. Sin embargo, frecuentemente nos referimos a este tipo de inhibición como inhibición lineal, ya que la representación de Kmap/Vmaxap o de 1/Vmaxap frente a [I] nos da una linea recta. Con menor frecuencia está el caso en que el complejo EI sí presenta cierta actividad catalítica residual (v  0) a concentraciones saturantes de inhibidor. Este tipo de inhibición se conoce como inhibición parcial, o inhibición hiperbólica, ya que la curva resultante al representar Kmap/Vmaxap o 1/Vmaxap frente a la [I], nos da una curva hiperbólica.

  8. * Ambos tipos de inhibición, lineal e hiperbólica, pueden a su vez subclasificarse de acuerdo con los parámetros cinéticos aparentes de Michaelis-Menten que se vean afectados, si bien, en lo que sigue, nos referiremos principalmente a la inhibición lineal. * La inhibición por inhibidores reversibles lineales, tradicionalmente, y de acuerdo con el mecanismo de reacción, se suele clasificar en tres grupos: - Inhibición competitiva --> Inhibidores competitivos - Inhibición no-competitiva --> Inhibidores no-competitivos - Inhibición acompetitiva --> Inhibidores acompetitivos

  9. 2.1. Inhibición competitiva En la inhibición competitiva o inhibición específica, el inhibidor compite con el sustrato por el mismocentro activode la enzima. La molécula del inhibidor es, generalmente, en todo o en parte, un isóstero del sustrato, excluyendose mutuamente del centro activo de la enzima. Isóstero --> Moléculas que tienen formas y tamaños similares

  10. Km kcatE + S <====> ES ----------> E + P I <=====> Kic EI --------> - Así pues, la enzima total, Eo, puede estar como enzima libre, E, unida al sustrato formando el complejo-ES, ES o como enzima unida al inhibidor formando el complejo-EI, (EI). Pero solamente el complejo ES puede dar producto. - Y de acuerdo con la ecuación de conservación de masas podemos escribir:

  11. [Eo] = [E] + [ES] + [EI] Vic = kcat [ES] Velocidad inicial en presencia de inhibidor competitivo El valor de la [ES] lo podemos obtener a partir de la cte de Michaelis: [E] [S] Km = ------------ [ES] [E] [S] [ES] = ----------- Km Y análogamente, el valor de la [EI] lo podemos obtener a partir de la definición de la constante de disociación del complejo EI: Kic

  12. [E] [I] Kic = ------------ [EI] [E] [I] [EI] = ------------ Kic Sustituyendo estos valores en la ec. de balance de masas, tenemos: Eo = E + ES + EI [E] [S] [E] [I] [Eo] = [E] + ------------ + ------------ Km Kic

  13. Valor de la Enzima libre [E] [S] [ES] = ----------- Km Vic=Kcat [ES] Ecuación representa el comportamiento cinético de un inhibidor competitivo puro

  14. Así pues, la velocidad de reacción inicial, en presencia de inhibidor competitivo vendrá dada por la ecuación: [S] vic = Vmax ----------------- [S] + Kmap - Ecuación semejante a la ec. de M&M, pero donde el valor de Kmapdepende de la concentración del inhibidor (I) y de la cte de inhibición Kic. * En este tipo de inhibición reversible, los valores de las ctes de inhibición, Kic, suelen ser del mismo orden que las Km. Oscilando entre 10-3 y 10-6 M.

  15. - Algunos inhibidores de este tipo suelen tener aplicaciones medico-farmacéuticas. ¿Cuáles serán los mejores?  aquellos que tengan un valor de Ki pequeño * En estos casos, además de interesante, es necesario determinar el valor IC50 o concentración de inhibidor que en unas condiciones dadas produce una inhibición del 50%. Cálculo del grado de inhibición, ei: Grado de inhibición es un valor entre 0-1 Razón entre la velocidad en presencia de I y en ausencia. Tarea Calcúlalo

  16. - El análisis de la ec. anterior nos indica que el valor del grado de inhibición, ei, depende: i) de la concentración de inhibidor, [I]; ii) del valor de la Kic; iii) de la concentración de sustrato, [S] iv) de la constante de Michaelis, Km - A concentraciones altas de sustrato, [S], el valor de inhibición puede ser no significativo. - Cuando ei = 0,5, es decir cuando hay una inhibición del 50% , el valor de IC50 viene dado por la ec. que hemos indicado anteriormente.

  17. Así pues, el valor IC50 para una inhibición competitivano puede considerarse como un valor característico del inhibidor, ya que depende de la concentración actual de sustrato, [S] y de la Km de la enzima para dicho sustrato. Pero realmente lo que es útil es calcular la concentración de inhibidor, [I], que causa un determinado grado de inhibición. P Calculemos la concentración de un inhibidor competitivo que causa una inhibición del 60% de la enzima E; sabiendo que la [S] = 2 10-3 M, Km = 10-3 M y que la Kic = 5 10-3 M

  18. Determinación gráfica de los parámetros cinéticos en una inhibición competitiva Podemos utilizar las mismas linealizaciones que para la ecuación de Michaelis-Menten; por ejemplo: * 1/vicvs 1/[S] --> Representación de Linenweaver-Burk * vicvs vic/[S] --> Representación de Eadie-Hoftee * [S]/vicvs [S] --> Representación de Hanes * vicvs [S] --> Representación directa o de Eisenthal- Cornish

  19. 1/v [I] > 0 [I] = 0 - 1/Km 1/Vmax 1/[S] -1/Kmap Representación de Linenweaver-Burk

  20. m = tga´ = -Kmap a´ Vmax/Kmap Representación de Eadie-Hoftee v Vmax m = tga = -Km a Vmax/Km [I] > 0 v/[S]

  21. [S]/v Representación de Hanes m = tga = 1/Vmax a - Km Kmap/Vmax Km/Vmax [S] -Kmap [I] > 0 I = 0

  22. Representación directa o de Eisenthal-Cornish Vmax v0 I = 0 [I] > 0 -S1 -S2 Km Kmap S0

  23. 2.2. Inhibición no-competitiva En una inhibición no-competitivael inhibidor se une a la enzima en un centro de unión diferente al centro activo de la enzima.

  24. Consecuentemente, las especies químicas en las que puede encontrarse la enzima serán: - la enzima libre, E, - la enzima unida al sustrato, ES (complejo-ES) - la enzima unida al inhibidor, EI (complejo-EI) - la enzima unida al sustrato y al inhibidor, ESI o EIS (complejo- ESI o EIS) En el caso de la inhibición no-competitiva pura suponemos que tanto la enzima libre, E, como el complejo-ES pueden unirse al inhibidor, y que la constante de disociación, Ki, es igual en ambos casos. E y EI unen al sustrato sin que afecten a las constantes de disociación (Km) - En este caso, también, sólo el complejo-ES evoluciona dando producto

  25. Los inhibidores no-competitivos, generalmente no presentan relación estructural con el sustrato, y se unen a la enzima en un sitio distinto del centro activo.

  26. Cuando [S]  no desaparece la inhibición.

  27. Km kcatE + S <====> ES ----------> E + P I I <=====> <=====> Ki Ki Km EI <=====> ESI ----------> * La deducción de la velocidad de reacción, en este caso, es análoga a la realizada en el caso de la inhibición competitiva: vinc = kcat (ES) [Eo] = [E] + [ES] + [EI]+ [ESI]

  28. [S] vinc = Vmaxap -------------------- [S] + Km - Así pues, en una inhibición no-competitiva pura, la Km de la enzima por el sustrato no se modifica, sin embargo, la Vmax sí se modifica, transformándose en una Vmaxap.

  29. * Determinación gráfica de los parámetros cinéticos en una inhibición no-competitiva - Podemos utilizar las mismas linealizaciones que para la ecuación de Michaelis-Menten, por ejemplo: *1/vincvs 1/[S] --> Representacion de Linenweaver-Burk vincvsvinc/[S] --> Representación de Eadie-Hoffte vincvs [S] --> Representación directa o de Eisenthal- Cornish

  30. 1/vinc (I) > 0 (I) = 0 1/Vmaxap 1/Vmax - (1/Km) 1/S Representación de Linenweaver-Burk

  31. Vmax/Km vinc/S m = -(1/Km) I = 0 Vmaxap I > 0 Vmaxap/Km Vmax vinc Representación de Eadie-Hoffte

  32. v0 Vmax (I) = 0 Vmaxap (I) > 0 -S1 -S2 Km S0 Representación directa o de Eisenthal-Cornish

  33. Cálculo del grado de inhibición, ei: [I] ei = ------------------- [I] + Ki Valor de la IC50 característica propia del inhibidor No depende de la [S] ni de la Km Valor IC50 es igual a la Ki

  34. 2.3. Inhibición acompetitiva * El tercer tipo de inhibición reversible es la inhibición acompetitiva, en la que el inhibidor sólo puede unirse al complejo-ES, formando un complejo-ESI, que no da producto. * En este caso como en los dos anteriores, únicamente el complejo-ES da producto de reacción.

  35. - De acuerdo con el siguiente esquema: Km kcatE + S <====> ES ----------> E + P <=====> I Ki ESI ----------> * Al igual que los otros dos casos, en este la velocidad de reacción viene dada por: viac = kcat (ES) [Eo] = [E] + [ES] + [ESI] Y por tanto su deducción se realizará de manera análoga.

  36. * Así pues, en una inhibición acompetitiva se modifica tanto Vmax como Km, y ambas se ven afectadas por el mismo factor multiplicativo Donde: [S] viac = Vmaxap ---------------- Kmap + [S]

  37. Del análisis de la anterior figura así como de la ecuación que nos da viac podemos observar que tanto la Vmax como la Km están disminuidas por un mismo factor: ¿No les parece paradójico que un inhibidor disminuya la Km de una enzima por el sustrato? Es decir, ¡que aumente la afinidad de la enzima por el sustrato! - La respuesta la podríamos tener en el mecanismo de inhibición * Al unirse el inhibidor al complejo-ES desplaza el equilibrio y, aparentemente, por lo tanto, la constante de disociación Kmap disminuye.

  38. : Determinación gráfica de los parámetros cinéticos en una inhibición acompetitiva (I) > 0 (I) = 0 1/viac 1/Vmaxap 1/Vmax - (1/Kmap) - (1/Km) 1/S Representacion de Linenweaver-Burk Tarea. Realiza representaciones gráficas con las otras representaciones

  39. 2.4. Representación de Dixon-Webb 1/vi S1 S2 > S1 S2 (I) -Ki Dixon y Webb propusieron una representación gráfica alternativa de la ecuación de inhibición competitiva y no-competitiva Representando 1/vi frente a [I], manteniendo constante la (S).

  40. En el caso de una inhibición competitiva, para dos concentraciones de sustrato fijas, (S1) y (S2), tendremos: S1 1 1 Km 1 Km ----- = --------- + ---------- ------ + ---------------------- [I] vic1 Vmax Vmax [S1] Vmax Ki [S1] S2 1 1 Km 1 Km ----- = ---------- + --------- ------ + ---------------------- [I] vic2 Vmax Vmax [S2] Vmax Ki [S2]

  41. - Estas dos rectas se cortarán en el único punto común que tienen, el correspondiente a 1/Vmax. La condición de corte de estas dos rectas es que 1/vic1 = 1/vic2 - Así pues, igualando ambas ecuaciones, simplificando y reordenando, llegamos a la siguiente ecuación:

  42. - Por definición 1/vic S1 S2 > S1 S2 1/Vmax -Ki (I) Luego, la solución a la anterior ecuación será: - De donde: * La representación gráfica de estas dos rectas:

  43. * En el caso de una inhibición no-competitiva: 1 1 Km 1 ----- = --------- (1+[I]/Ki) + -------- ------ (1+[I]/Ki) vinc1 Vmax Vmax (S1) S1 S2 1 1 Km 1 ----- = --------- (1+[I]/Ki) + -------- ------ (1+[I]/Ki) vinc2 Vmax Vmax (S2) - Estas dos rectas se cortarán cuando 1/vinc1 = 1/vinc2. * Operando de manera análoga al caso de la inhibición competitiva, obtenemos: - Como por definición:

  44. S1 S2 > S1 S2 [I] -Ki => 1 + (I)/Ki = 0 (I) = -Ki Luego: -Sustituyendo este valor en la ecuación que define 1/vinc, obtenemos: 1/vinc1 = 1/vinc2 = 0 - Luego las rectas se cortan en un punto, sobre el eje (I), tal que (I) = -Ki 1/vinc1

  45. 2.5. Inhibición por exceso de sustrato Km kcatE + S <====> ES ----------> E + P <=====> S Ks´ ES2 ----------> v = kcat (ES) * Este es otro tipo de inhibición reversible en el que un exceso de sustrato provoca una pérdida de actividad de la enzima. * En este caso, el modelo cinético presupone que una segunda molécula de substrato puede unirse al complejo-ES dando lugar a la formación del complejo-ES2 que no da producto: Suponemos que la constante de disociación del segundo complejo [ES2] es diferente a la Km Se denomina Ks´ - La ecuación de velocidad, como siempre, la podemos deducir a partir de:

  46. Ecuación de conservación de la enzima Eo = E + ES + ES2 [E] [S] [ES] = ----------- Km v = kcat [ES]

  47. v Vmax (S)op (S) La representación de v frente a (S) muestra una curva que presenta un máximo: La concentración de sustrato a la cual se obtiene el máximo el óptimo de velocidad Igualando a cero la primera derivada con respecto a la [S]

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