Rauga genoma funkcionālā raksturošana ar gēnu izslēgšanas metodi

1. Rauga genoma funkcionālā raksturošana ar gēnu izslēgšanas metodi Juris Ķibilds Kurss Ģenētiskais eksperiments 27.03.2014.

2. Ievads • 1996. gadā tika publicēts maizes rauga Saccharomyces cerevisiae genoms • 12,1 Mb, 6000+ gēnu • Kā noteikt katra gēna (ORF) funkciju organismā? • Gēnu izslēgšana ar nejaušo mutaģenēzi, nejaušu transpozonu integrāciju, genetic footprinting • Mērķtiecīga un kontrolēta gēnu izslēgšana

3. Mērķtiecīga gēnu izslēgšana • Tradicionālā pieeja līdz 1993. gadam – mērķa gēnu klonē plazmīdā, integrē tajā dominantu marķieri, veic restrikciju un ar restrikcijas fragmentu transformē šūnas. Laikietilpīgi, kā arī ierobežo restrikcijas enzīmu klāsts • 1993. gadā Baudin et al. piedāvā ātrāku un vienkāršāku paņēmienu, izmantojot tikai PCR

4. Metodes apraksts • Divas secīgas PCR reakcijas: • KanMX modulim (Wach et al. 1994) pievieno iezīmes (TAG) sekvences (molekulāro svītrukodu) • Pievieno šim fragmentam attiecīgo ORF ieskaujošās sekvences • Transformācija • Homologās rekombinācijas pārbaude (PCR) • Kvantitatīva un kvalitatīva fenotipu analīze

5. Yeast Deletion Web Pages: http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/

6. Kvantitatīvā fenotipēšana • Audzē vienlaicīgi daudzus delēciju celmus selektīvos apstākļos (vienkopus) • Izdala DNS, veic PCR ar TAG sekvenču kopīgajai daļai atbilstošiem fluorescenti iezīmētiem praimeriem • Veic PCR produktu hibridizāciju uz mikročipa, pēc fluorescences intensitātes kvantificē katra fenotipa spēju augt dotajos apstākļos Winzeler et al. 1999 Shoemaker et al. 1996

7. Mīnusi Plusi • Mērķa ORF tiek pilnībā aizvietots, nepieļaujot kaut vai daļēji funkcionāla gēna produkta veidošanos • Rezultātā uzreiz pieejami celmi ar nulles alēlēm, nav problēmu atrast izslēgto gēnu • Vienlaicīgi var analizēt fenotipus ļoti lielam celmu skaitam • Ļauj detektēt un kvantificēt pat nelielas izmaiņas augšanas ātrumā (pielāgotībā selektīvajiem apstākļiem) • Darbietilpīgi (taču ir iespējas optimizēt un automatizēt) • Dažādu iemeslu dēļ ne visus ORF izdodas aizvietot

8. Pielietojuma piemērs • Yeast Knock Out (YKO) bibliotēka (1993-2000) • Izslēgti 90% ORF • Pieejami visi izveidotie S. cerevisiae celmi, katrs iezīmēts ar unikālu TAG sekvenci • Atjaunināta un papildināta Winzeler et al. 1999

9. Izmantotie avoti • Baudin, A., et al. A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 21, 3329-3330. (1993) • Giaever, G., et al. Functional Profiling of theSaccharomyces cerevisiae Genome. Nature 418, 387-391. (2002) • Shoemaker, D., et al. Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly parallel molecular bar-coding strategy. Nature Genetics. 14, 450-456. (1996) • Winzeler, E., et al Functional Characterization of the Saccharomyces cerevisiae Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis. Science. 285, 901-906. (1999) • Yeast Deletion Web Pages: http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/

10. Pateicos par veltīto uzmanību!

11. Jautājums • Kāds elements ļauj paralēli vienā kultivācijā analizēt daudzus celmus (gēnu izslēgšanas ietekmi uz augšanas ātrumu)?