Biosensores

1. Biosensores “Instrumentos analíticos que transforman procesos biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su cuantificación”

2. muestra La nariz como biosensor Aparato medidor Detector biológico Transductor Célula nerviosa Cerebro Membrana olfatoria

3. Biosensores Analito (sustrato) Procesador de la señal Señal Transductor Elemento biológico de detección Elemento detector que responde al sustrato que se está midiendo es biológico en su naturaleza Capa delgada de material biológico activo en contacto con transductor eléctrico Transductor convierte cambio observado (físico/químico) en señal cuantificable Señal electrónica con magnitud proporcional a concentración de un compuesto específico Especificidad y sensibilidad de sistemas biológicos con poder informático de microprocesador

4. Ann NY Acad Sci, 1962 Nature, 1967

5. El analito o sustrato cualquier sustancia consumida o producida en un proceso biológico paracetamol etanol ácido láctico aspirina TNT azucares fosfato ácido glutámico urea colesterol creatina penicilinas aminoácidos

6. El componente biológico Interacción con el sustrato altamente específica Evitando interferencias de otras sustancias Catalización de la reacción (más común) Unión selectiva al sustrato Otros componentes que contienen enzimas como: Microorganismos (levaduras y bacterias) Material tisular (plátano o hígado) Anticuerpos Ácidos nucleicos

7. El componente biológico VENTAJAS Alta especificidad Discriminación Detección en mezclas complejas Estructura Concentraciones Sin tratamiento previo

8. Métodos de inmovilización Componente biológico siempre en contacto íntimo con el transductor Unión covalente o no covalente Membrana delgada recubriendo superficie de detección Distancia entre lugar de reacción y lugar donde ocurre la transducción eléctrica Adsorción a la superficie (más simple) Microencapsulación (membranas) Atrapamiento (matriz de gel, pasta o polímero) Unión covalente (enlaces químicos entre componente biológico y transductor) Entrecruzamiento (agente bifuncional)

9. Factores de rendimiento Selectividad Característica más importante Discriminación entre sustratos Función del componente biológico Sensibilidad Normalmente rango sub-milimolar (10-3 M) Casos especiales fentomoles (10-15 M) Precisión Alrededor de ± 5 %

10. Factores de rendimiento Naturaleza de la solución pH Temperatura Fuerza iónica Tiempo Tiempo de respuesta más largo que sensores químicos (30 seg) Tiempo de recuperación (pocos minutos) Vida útil por inestabilidad del material biológico (días a meses)

11. BIOSENSORES • Utilizan la especificidad de los procesos biológicos: • Enzimas x Sustratos • Anticuerpos x Antígenos • Lectinas x Carbohidratos • Complementariedad de ácidos nucleicos. • Ventajas: • Reutilización • Menor manipulación • Menor tiempo de ensayo • Repetitividad • Tipos y usos mas comercializados: • Tiras colorimétricas • Electroquímicos: • Potenciométricos: Glucosa, Lactato, Glicerol, Alcohol, Lactosa, L-aminoácidos, Colesterol • Amperométricos: Glucosa, Sacarosa, Alcohol • Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.

12. Propiedades de un buen Biosensor

14. BIOSENSORES • Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas. • Consultas y Urgencias Hospitalarias: • Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales • Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento • Menor riesgo de deterioro de la muestra • Diagnóstico Doméstico: • Ensayos de Embarazos • Control de Glucosa en diabéticos • Aplicaciones in vivo: • Páncreas artificial • Corrección de niveles de metabolitos • Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad • Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales: • Alimentación • Cosmética • Control de Fermentaciones • Controles de Calidad • Detección de Explosivos • Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas • Control de polución.

15. TIPOS DE BIOSENSORES • BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS • Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox • Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones • Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones • BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS • BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS • BIOSENSORES ÓPTICOS • De onda envanescente • Resonancia de plasma superficial • BIOSENSORES CELULARES • INMUNOSENSORES

16. UNIDADES FUNCIONALESDE UN BIOSENSOR

17. Material biológico + Analito Analito unido Respuesta biológica Respuesta Electrónica Respuesta electrónica (Máxima respuesta electrónica posible) x (Concentración del analito) = (Constante de semisaturación) + (Concentración del analito)

18. Cinéticas de reacción en biosensores

19. Biosensores ElectroquímicosAmperométricoselectrodo de oxígeno

20. Biosensores ElectroquímicosAmperométricoselectrodo de oxígeno Reacciones redox catalizadas por enzimas Voltaje constante entre dos electrodos Corriente debida a la reacción de los electrodos

21. Electrodo de Oxígeno En este principio se basa el primer y más sencillo biosensor Determinación de glucosa Electrodo de oxígeno de Clark

22. Electrodo de Oxígeno (A) Disco de resina epoxy (B) Cátodo de platino en el centro de un saliente. (C) Ánodo de plata en forma circular (D) Anillo de goma que sostiene un papel espaciador empapado en un electrolito y una membrana de polytetrafluoroethylene que separa los electrodos de la mezcla de reacción.

23. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA La glucosa se determina por la disminución de la concentración de oxígeno molecular disuelto cuando la glucosa oxidasa cataliza la reacción redox

24. E l e c t r o d o d e o x í g e n o - - O + 2 H O + 2 e H O + 2 O H 2 2 2 2 - - 2 H O + 2 e 2 O H 2 2 C á t o d o ( P t ) A n o d o ( A g ) + - 4 A g 4 A g + 4 e + - 4 A g + 4 C l 4 A g C l DETERMINACIÓN DE GLUCOSA Entre el cátodo central de platino y el ánodo circundante de plata se aplica un potencial de 0.6 voltios. El circuito se cierra con solución saturada de KCl. El oxígeno molecular disuelto se reduce en el cátodo de platino. Se liberan electrones y se produce corriente eléctrica que se puede medir. P u e n t e d e K C l - 4 e - + 0 , 6 - 0 , 7 v

25. Invertasa Glucosa-oxidasa Glucosa Sacarosa Electrodo O2 Fructosa Glucosa D-gluconolactona H2O2 respuesta glucosa sacarosa tiempo DETERMINACIÓN DE SACAROSA flujo

26. DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO

27. DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO Tras la muerte, los nucleótidos del pescado sufren una serie de reacciones de degradación progresiva: ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico La acumulación de inosina e hipoxantina respecto de los nucleótidos es un indicador del tiempo que hace que el pez murió y de sus condiciones de conservación, por tanto, de su frescura.

28. DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO BIOSENSOR: xantina-oxidasa y nucleósido-fosforilasa inmovilizadas sobre una membrana de triacilcelulosa de un electrodo de oxígeno K < 20 El pescado puede ser comido crudo 20 > K < 40 El pescado debe ser cocinado K > 40 Pescado no apto para el consumo Los nucleótidos se podrían determinar utilizando el mismo electrodo y muestra, pero añadiendo nucleotidasa y adenosín-deaminasa

29. DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico Ensayo simple para determinar de forma segura y fiable la frescura del pescado, que tiene gran importancia para la industria. La determinación de frescura en las inspecciones sería completamente subjetiva.

30. Biosensores Electroquímicos Amperométricos Ventaja: Fáciles de fabricar. Desventajas: Reacción dependiente de concentración de oxígeno. Ambientes anaerobios. Otros procesos redox. Oxidación/reducción de vitamina C. Interferencia. Sustitución del oxígeno por otras sustancias.

31. La reacción mediada por el biosensor está compuesta por tres procesos redox sustrato + enzima (oxidada) producto + enzima (reducida) reacción enzimática enzima (reducida) + mediador (oxidado) enzima (oxidada) + mediador (reducido) reacción enzimática reacción electrodo mediador (oxidado) + e- mediador (reducido)

32. Mecanismos redox para diferentes configuraciones de biosensores amperométricos

33. Mediadores redox en biosensores amperométricos Oxidasas más especfíicas para el reactivo a oxidar Rápidas velocidades de transferencia de electrones Capacidad para ser regenerados fácilmente Retenibles en membrana biocatalítica No reaccionar con otras moléculas, incluyendo oxígeno molecular

34. Mediadores redox en biosensores amperométricos Tetracianoquinodimetano aceptor parcial de electrones Ferroceno, tetratiofulvaleno y N-metil fenazinio donantes parciales de electrones Hidroquinona y ferrocianuro mediadores solubles

35. Biosensor que detecta concentración de glucosa en sangre. Construido y vendido para el control de los enfermos diabéticos.

36. Área de detección dispositivo con electrodo de un solo uso Deposición sobre una tira de plástico. Consta de electrodo de referencia Ag/AgCl y electrodo de carbono con glucosa oxidasa y mediador de ferroceno Ambos electrodos cubiertos con tejido hidrofílico. Paso de moléculas de diferente tamaño, difusión homogenea, evita evaporación desigual Duración 6 meses Detección 2-25 mM en una gota de sangre Resultado en 30 segundos

37. Miniaturización Posible por la capacidad del pirrol para polimerizar mediante oxidaciones electroquímicas en condiciones suficientemente suaves como para atrapar enzimas y mediadores sin desnaturalizarlos

38. Microelectrodo glucosa/lactato Se puede recubrir la superficie de pequeños electrodos polimerizando pirroles junto con biocatalizadores y mediadores, utilizando métodos de microfabricación de microprocesadores, e incluso disponiendo varios sensores en los mismos

39. Biosensores Electroquímicos Potenciométricos Determinan cambios en la concentración de iones concretos

40. Biosensores Electroquímicos Potenciométricos Usan electrodos selectivos para ciertos iones Electrodos ion-selectivos. pHmetro Baratos Determinación de varios analitos Mayor velocidad Muy poca muestra Necesidad de compensación de la temperatura

41. Biosensores Potenciométricos

42. Biosensor Potenciométrico

43. Biosensores Electroquímicos Conductimétricos Detectan cambios en conductividad eléctrica causados por alteraciones en la concentración de iones

44. Biosensores Electroquímicos Conductimétricos En muchos procesos biológicos se producen cambios en concentraciones iónicas Estos cambios pueden ser usados por biosensores que detecten cambios en la conductividad eléctrica

45. NH2CONH2 +3H2O Ureasa 2HN 4+ + HCO3- + OH- Sensor de Urea Ureasa inmovilizada Cirugía renal y diálisis Reacción provoca gran cambio en concentración iónica

46. Sensor de Urea Un campo alternante entre dos electrodos permite la determinación de los cambios en conductividad, evitando procesos electroquímicos no deseados Electrodos dispuestos para ocupar mínimo espacio 0.1 y 10 mM de urea

47. NH2CONH2 +3H2O Ureasa 2HN 4+ + HCO3- + OH- Sensor de Urea Otros ejemplos: amidasas, decarboxilasas, esterasas, fosfatasas y nucleasas.

48. Biosensores Termométricos“Sensores bioquímicos y TELISA” La producción de calor es una propiedad general de muchas reacciones enzimáticas Base de los biosensores calorimétricos o térmicos

49. Biosensor termométrico

50. Biosensor termométrico Los cambios ambientales no afectan a los cambios de temperatura detectados Reacción confinada en dispositivos termoaislados (a) Precisa un aislamiento correcto La corriente del analito pasa a través de un intercambiador de calor (b)