Heteroduplex Heteroduplex mobility assay

1. Biotechnologia III rok Sylwia Borkowska Małgorzata Gawlik Piotr Gawroński HeteroduplexHeteroduplex mobility assay

2. Heteroduplex jest dwuniciową molekułą kwasu nukleinowego powstającą podczas rekombinacji homologicznej z pojedynczych komplementarnych nici, pochodzących z różnych źródeł, np. z dwóch homologicznych chromosomów, czy nawet z dwóch różnych organizmów. Jednym takim przykładem jest heteroduplexowe DNA tworzone w czasie hybrydyzacji materiałów genetycznych organizmów w celu ustalenia ich pokrewieństwa czy pochodzenia ( badania filogenetyczne). Definicja

3. Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji:(w kompleksie synaptonemalnym podczas koniugacji poprzedzającej mejotyczny crossing-over )

4. Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji: • Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji umożliwiają wymianę genów, a przez to także naprawę uszkodzonych jednostek .

5. Zastosowania • badania filogenetyczne • analizy epidemiologiczne, np odnośnie Cryptosporidium wyizolowanych od ludzi i zwierząt • badania screeningowe dotyczące wielu groźnych wirusów: HIV-1, WZW typu C, enterowirusów, w celu identyfikacji ich podtypów • wykrywanie mutacji głównie punktowych i chorób genetycznych z nimi związanych (można analizować tylko krótkie odcinki kwasów nukleinowych, bo przeważnie na wstępie stosuje się PCR, nie wykryjemy tą metodą mutacji chromosomowych i genomowych).

6. Podstawowe założenie: • Nici DNA tworzące Heteroduplexyróżnią się od siebie pewnymi sekwencjami i nie tworzątak stabilnych układów jak homoduplexy, czyli molekuły dwuniciowego DNA komplementarne do siebie.

7. Chcąc wykryć w mieszaninie, po reakcji PCR, Heteroduplexy (odróżnić je od homoduplexów) możemy posłużyć się się metodami: • DGGE- (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)- elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym, która jest najdokładniejsza- ma 95 % skuteczność, ale i najdroższa • mismatch cleavage (rozłupywanie się niedopasowań) • DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)- Szybka chromatografia w roztworze denaturującym

8. Opis DHPLC przy wykrywaniu mutacjiSzybka chromatografia w roztworze denaturującym

9. DHPLC • mieszanina po reakcji PCR zawierająca DNA wzorca-niezmutowane i DNA organizmu badanego- potencjalnie obarczone mutacją) • Denaturacja (podgrzanie) • Renaturacja (ochłodzenie) • tworzą się homo- i heteroduplexy

10. DHPLC • Rozdział Hetero- od Homoduplexów jest osiągany poprzez działanie częściowo denaturujących czynników (temp. 57 °C) • Rejestrowane są mikronapięcia towarzyszące przechodzeniu przez urządzenie cząsteczek DNA

11. DHPLC • DNA jednoniciowe będzie pochodziło z heteroduplexów i jeżeli zostanie wykryte przez detektor w odpowiednio wysokim stężeniu, będzie to świadczyło o mutacji w obrębie DNA badanego • Jeśli DNA organizmu badanego będzie homozygotą pod wzlędem mutacji, to otrzymamy największy udział Heteroduplexów w mieszaninie po PCR, a stężenie nici pojedynczych wykrytych podczas DHPLC będzie wysokie, • W przypadku heterozygotyczności pod względem mutacji DNA badanego otrzymamy mniejsze stężenie pojedynczych nici i dlatego dobrze jest wtedy powtórzyć DHPLC bez obecności wzorca-nie jest ona wymagana, bo DNA badane jest Heteroduplexem • brak mutacji-brak heteroduplexów.

12. Wynik DHPLC • DHPLC detection of mutation in the Fanconi anemia gene, exon-4 in Ashkenazi population.

13. Źródła informacji: • NCBI • Wikipedia