Enzimas – Parte 2

1. Enzimas – Parte 2 JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Estágio em Docência Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008

2. Enzimas • Atividade enzimática • Produção industrial de enzimas • O processo fermentativo; • Separação de enzimas intra e extracelulares; • Purificação; • Controle de pureza; • Produto final.

3. Atividade Enzimática • As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas • O que importa não é a massa, mas a atividade Conserva a massa protéica Proteínas desnaturadas Sem atividade catalítica

4. Atividade Enzimática • Dosagem: através da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza ([S] ou [P]) uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) velocidade constante Produto µmol/mL Tempo (min.)

5. Atividade Enzimática • Dosagem: através da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) velocidade decresce Produto µmol/mL ↓ [ ] de substrato: -inativação parcial da enz., -inibição por produto. Tempo (min.)

6. Atividade Enzimática • Dosagem: através da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) velocidade constante Para evitar a influência destes fatores associar- se: atividade medida da velocidade de reação em condição inicial (Veloc. Constante) Produto µmol/mL velocidade decresce ↓ [ ] de substrato: inativação parcial da enz., inibição por produto e deslocamento do equilíbrio (reação reversível). Tempo (min.)

7. Atividade Enzimática • A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades Internacionais (UI). 1 UI é a quantidade de enzima capaz de formar 1µmol de produto por minuto em condições ótimas

8. Atividade Enzimática • Métodos para a determinação da atividade de enzimas: • Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo. • Métodos para avaliar as [ ] das espécies: • Muito diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria... • Menos diretos: - Medida da Viscosidade.

9. Atividade Enzimática • A medida da atividade enzimática é imprescindível para monitorar a purificação de uma enzima. • A atividade específica: número de Unidades de enzima miligramas de proteína • Portanto se a etapa de purificação for bem sucedida a atividade específica deve Significa que o procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis.

10. Atividade Enzimática • Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo. 2 mL 8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC Caldo contendo a enzima Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min  2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml

11. Atividade Enzimática • Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo. 2 mL 8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC Caldo contendo a enzima Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min  2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml 1 mL - 60mg amido – 1 h

12. Produção Industrial de Enzimas • Fonte Lípase Pancreática, Pepsina Animais Bromelina, Papaína Vegetais Lactase: S.fragilis, Lipase: A.niger Microrganismos

13. Produção Industrial de Enzimas • A produção se faz majoritariamente por fermentação submersa • Nos países orientais há uma tradição estabelecida de utilização da fermentação semi-sólida. Interessante para países que dispõem de resíduos agroindustriais - baixo custo

14. Produção Industrial de Enzimas • Processo importantes prévios à fermentação preparo do inóculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada. • Decorrido o tempo suficiente, essa cultura é inoculada no fermentador principal. • Quantidade de inoculo: 1 a 10% (p/v) • A produção da enzima pode ser afetada por esse parâmetro.

15. Produção Industrial de Enzimas Linhagem microbiana Sigilosamente protegida Composição dos meios de cultivo Quimicamente conhecidos (sintéticos) Matérias-primas naturais Fontes de carbono e energia, nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento

16. Produção Industrial de Enzimas • Fermentadores • Mecanicamente agitados; • 10.000 a 100.000 litros; • Operados de modo descontínuo (batelada); • Munidos de camisas ou serpentinas internas para as necessidades de aquecimento e refrigeração; • Sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido e espuma); • As fermentações em batelada para produção de enzimas tem duração da ordem de 30 a a150 h.

17. Produção Industrial de Enzimas • Processo a jusante (downstream) da fermentação • As operações que se seguem ao processo fermentativo • Dependem da localização da enzima de interesse Intracelular Extracelular

18. Extração – Enzimas Extracelulares • O caldo é resfriado a cerca de 5°C, • Estabilidade do produto e • Evitar o crescimento de microrganismos contaminantes. • O pH é geralmente ajustado para o valor ótimo de atuação da enzima. • A separação das células Centrifugação Filtração

19. Extração – Enzimas Extracelulares Solução clarificada contendo a enzima (livre de células) Concentração Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos com menbranas) Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)

20. Extração – Enzimas Extracelulares Solução clarificada contendo a enzima (livre de células) Concentração Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos com menbranas) Esta solução diluída a níveis convenientes e acondiciona com estabilizantes da atividade enzimática pode ser embalada para comercialização. Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)

21. Extração – Enzimas Intracelulares Caldo de Cultivo Centrifugação Romper as Células Biomassa

22. Extração – Enzimas Intracelulares Moagem com Esferas de Vidro Homogeneização em Alta Pressão Romper as Células Tratamentos Enzimáticos Sonificação Tratamentos Químicos

23. Extração – Enzimas Intracelulares • A ruptura das células libera inúmeras substâncias para o meio aquoso Ácidos Nucléicos Precipitação Mn II Sobrenadante Filtração Ultrafiltração Concentrado Concentração à vácuo

24. Purificação Forma de apresentação e pureza Concentrado Enzimático Processo Iguais

25. Purificação Forma de apresentação e pureza Concentrado Enzimático Processo Iguais Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização (spray drying) diluída pode ser um produto comercializável

26. Purificação Forma de apresentação e pureza Concentrado Enzimático Processo Iguais Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização (spray drying) Peletizacao ou aglomeração diluída pode ser um produto comercializável Padronização da atividade com material sólido inerte

27. Purificação • Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. (NH4)2SO4 Concentrado Enzimático Precipitação Moléculas Proteicas Centrifugação

28. Purificação • Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. solventes (etanol, metanol) (NH4)2SO4 Concentrado Enzimático Precipitação Moléculas Proteicas Centrifugação

29. Purificação • Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. solventes (etanol, metanol) (NH4)2SO4 Concentrado Enzimático Precipitação ultrafiltração, microfiltração e osmose inversa Moléculas Proteicas Centrifugação

30. Purificação • Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, técnicas cromatográficas são empregadas Cromatografia de Troca Iônica Carga das Moléculas Cromatografia de partição ou de filtração em gel Tamanho da Moléculas Ligação bio-específica da enzima com os ligantes (substratos ou inibidores) Cromatografia de Afinidade

31. Purificação • A concentração pode ser obtida das seguintes formas: Purificação por Cromatografia Concentração Poros pequenos. Remove cerca de 70% da H2O Adição de um polímero tipo Sephadex G-25 Remoção do solvente por membrana semi-permeável Ultrafiltração Remoção de água sob vácuo Liofilização

32. Purificação • Controle de Pureza: • Eletroforese. • Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas com a aplicação de uma diferença de potencial • As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga. • Das muitas técnicas de análise de proteínas, a eletroforese em gel é a + versátil e facilmente aplicável, • é tão sensível que se podem detectar proteínas que só diferem em um aa.

33. Purificação • O grau de purificação almejado esta relacionado à aplicação do produto. No mercado estão disponíveis: • Preparações pouco purificadas, para uso técnico ou industrial; • Preparados de alto grau de pureza para uso analítico ou farmacêutico.

34. Purificação

35. Produção Industrial de Enzimas Caldo Fermentado Enzima Intracelular Enzima Extracelular Separação sólido/líquido Separação sólido/líquido Rompimento Celular Precipitação Ác. Nucléicos Concentração Concentração Purificação

36. Produção Industrial de Enzimas Benefícios ambientais de trabalhar com enzimas: - São produzidas de fontes renováveis. - São completamente degradáveis. - Propiciam economia de energia, água, (condições brandas de temperatura, pH e pressão minimizando a degradação térmica dos produtos finais).