Návod na testování aktivity fluorescenční čočky s imobilizovaným enzymem pomocí zařízení Safibra

1. Návod na testování aktivity fluorescenční čočky s imobilizovaným enzymem pomocí zařízení Safibra

2. Bioreaktor • Termostat • Clarkova kyslíkova elektroda • Fluorescenční sonda • Jemné nastavení intenzity záření • Hrubé nastavení intenzity záření • Zapínače kanálů • Přívod vzduchu a dusíku • Připojení k termostatu • Bio Console • Bio Controller • Počítač pro ovládání zařízení Safibra • SOMS5 pro zapnutí detektoru záření • Detektor záření Safibra 13 11 10 16 15 14 2 1 12 15) Tlaková nádoba s N2 16) Vzduchový ventil

3. 4 3 8 9 9 7 5 6

4. Vložení čočky do bioreaktoru

5. 1 2 3 • Naplň bioreaktor pufrem nebo médiem a vlož vhodné míchadlo. • Pomocí pinzety umísti fluorescenční čočku na optickou sondu (obr. 1-3).

6. 1 2 c b a 3) Připoj Clarkovu elektrodu (obr. 1 a 2). • Uzavři bioreaktor a připoj bílou hadici na přívod vzduchu (c). • Připoj bioreaktor k termostatu (a – přívod vody z termostatu, b – odvod vody do termostatu) .

7. 1 2 • Zakryj zdroj záření a bioreaktor černým hadrem . • Zapni termostat (označeno na obr. 1). • 3) Červeným ventilem zapni přívod vzduchu do bioreaktoru (obr. 2). • Zapni zdroj záření SOMS5 (obr. 3) • Zapni počítač (přihlášení jméno – host, heslo – Heslo1)

8. 6) Zapni řídící jednotku Bio Console. Rozsvítí se obrazovka řídící jednotky Bio Controller ADI 1010.

9. Spouštění programu pro měření lifetimu fluorescence

10. 2 1 2) Objeví se okno Data acquisition 2.0 Vyčkej statusu Ready. 1) Na ploše obrazovky počítače připojenému k detektoru záření vyber ikonu Safibra Sync. 2.0_new (na obr.)

11. V ikoně Measure vyber program Fluorescence miltipoint new sensor (SYNCDET).

12. Objeví se následující okno Fluorescence measurement - multipoint.

13. V okně Parameters 1) vyplň Start ch.: 1 a Stop ch.: 1, 2) vyplň Time constant 10, 3) zruš zaškrtnutí generate automatically, 4) pomocí napěťového šroubu detektoru nastav nastav intenzitu prvního okna

14. 1) Otevři TotalCommander. 2) Zkopíruj cestu pro uložení dat do pole Output point (zmáčkni v TotalCommanderu pravým tlačítkem na horní řádek s adresářem – zmáčkni Ctrl+C – V řádku Output file zmáčkni Ctrl+V). 3) Za lomítko adresáře napiš jméno souboru pro uložení dat ve formě: nazev.csv.

15. V okně Status vyber Manual channel switch 1. Channel0se změní v1

16. Zmáčkni tlačítko Open graph.Objeví se černé okno časové závislosti doby života fluorescence.

17. Kalibrace doby života fluorescence senzoru na aerobně-anaerobní podmínky

18. Nastavení aerobních podmínek, tj. minimální hodnoty doby života fluorescence.

19. Krok 4 Krok 6 • Nastav 15% průtok vzduchu do biorektoru: • Na řídící jednotce Bio Controller zmáčkni tlačítko Menu. • Černým kolečkem vyber Manual Control. • Zmáčkni tlačítko Menu. • Černým kolečkem vyber Air Massflow Controller (na obr.). • Zmáčkni tlačítko Start/Stop. • Černý kolečkem nastav 15% (na obr.). • Zmáčkni postupně tlačítka Start/Stop a Setp.

20. Detail Po nastavení průtoku vzduchu do biorektoru vyletí kulička v průtokoměru na jednotce Bio Console. Zmáčkni tlačítko Start v ikoně programu Fluorescence measurement.

21. V okně grafu se objeví šum doby života fluorescence v aerobních podmínkách.

22. Krok 3 Krok 5 • Po nasycení média/pufru v bioreaktoru kyslíkem nakalibruj na jednotce Bio Controller Clarkovu kyslíkovou elektrodu na 100% nasycení kyslíkem: • Zmáčkni tlačítko Calib. • Zmáčkni tlačítko dO2. • Černým kolečkem vyber Calibration (na obr.). • Zmáčkni tlačítko Calib. • Černým kolečkem nastav 100% (na obr.). • Zmáčkni tlačítko Calibration. • Zmáčkni tlačítko Setp. • Třetí sloupec v Bio Controller ukazující koncentraci O2 v bioreaktoru se nastaví na 100% (na obr.). Krok 8

23. Nastavení anaerobních podmínek

24. Vypni přívod vzduchu do bioreaktoru - viz str. 19 s tím rozdílem, že se hodnota Air Massflow Controller přenastaví černým kolečkem z hodnoty 15% na 0 %.

25. 1) Vypni přívod vzduchu do bioreaktoru - viz str. 19 s tím rozdílem, že se hodnota Air Massflow Controller přenastaví černým kolečkem z hodnoty 15% na 0 % Krok 3 Krok 2 1 2 3 2) Zapni přívod dusíku do bioreaktoru postupným zapnutím ventilů 1, 2 a 3. 3) Na jednotce Bio Console nastav ventilem 3 průtok dusíku na 1 ml/min.

26. 1 1 2 V okně časové závislosti doby života fluorescence se vlivem snižující se koncentrace O2 v bioreaktoru postupně zvyšuje hodnota doby života fluorescence (obr. 1). Po poklesu koncentrace O2 v bioreaktoru (jednotka Bio Console na obr. 2), vyčkej ustálení lifetimu fluorescence při anaerobních podmínkách (na obr. 2)

27. Opětovné nastavení aerobních podmínek

28. 1) Postupně vypni přívod N2 do bioreaktoru v pořadí ventilů na dusíkové bombě 3, 2 a 1 (str. 25). 2) Zapni přívod O2 do bioreaktoru (str. 19). 3) Vyčkej poklesu hodnoty lifetimu fluorescence na původní hodnotu.

29. Testování odezvy fluorescenčního senzoru s enzymem na koncentraci substrátu

30. nástřik Krok 2 Krok 3 1) Stříkačkou naber vzorek substrátu. 2) Skleněnou tyčinkou ve víku bioreaktoru nastříkni vzorek substrátu do bioreaktoru (na obr.). 3) Odezva enzymu imobilizovaného na fluorescenční čočce se projeví vzrůstem (schodem) lifetimu fluorescence v grafu.

31. Popis oken programu Fluorescence measurementmultipointnewsensor

32. TAU – doba života fluorescence CHANNEL – nastavený měřící kanál detektoru INTENSITIES – intenzity fluorescence ve 4 oknech (intenzita v 1. okně max. 9.999 E 6) TIME CONSTANT – RANGE – měřicí rozsah OKNO PARAMETERS READOUT PERIOD – časová perioda snímání dat doby života fluorescence CHANNEL SWITCH PERIOD – Start ch., Stop ch. – TIMECONST DELAY – SAMPLE NAME, OPERATOR NAME, NOTE – pole pro vpisování poznámek k experimentům OUTPUT FILE – pole pro vkládání cesty pro uložení dat

33. OKNO STATUS VALUES MEASURED– počet naměřených dat CURRENT DATA MARKER – počet poznámek vložených do grafu DATA MARKER NOTE – vložení poznámky do grafu (vožení pomocí tlačítka Set new marker) MANUAL CHANNEL SWITCH – nastavení použitého kanálu detektoru OPEN GRAPH – otevření okna časové závislosti doby života fluorescence GRAPH TIME SCALE, GRAPH Y-SCALE – nastavení měřítek os grafu

34. OKNO ADDITIONAL CONTROLS NENASTAVUJE SE!!!! Slouží ke kalibraci programu pro různé čočky

35. OKNO O2 CONCENTRATION Nemusí se nastavovat!!! Kalibrace koncentrace kyslíku v bioreaktoru (měřeno Clarkovou elektrodou) na dobu života fluorescence.

36. OKNO FAULT DETECTION NENASTAVUJE SE!!! DETERMINATION COEFFICIENT OF EXPONENTIAL FIT – koeficient pro vypočítání doby života fluorescence FLUORESCENCE DECAY GRAPH – graf zhášení fluorescence

37. OKNO LOG Ukládání softwarových procesů